SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用；本发明专利技术的意义在于：双氢青蒿素可调控脾脏免疫细胞的异质性。SOD3

【技术实现步骤摘要】
SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用


[0001]本专利技术涉及医药
，主要涉及到SOD3蛋白缺失在缓解双氢青蒿素诱导的脾增大及免疫细胞异质性方面的应用。

技术介绍

[0002]双氢青蒿素(DHA)，作为青蒿素的一种衍生物谢物，比青蒿素本身表现出更强的抗疟疾作用，同时也被公认为是一种免疫调节剂。研究表明，高浓度的双氢青蒿素可以抑制体液免疫反应，此外，双氢青蒿素还可以抑制氧化应激以及活性氧(ROS)积累以改善炎症。而作为主要的抗氧化酶，超氧化物歧化酶(SOD) 在清除ROS中起着至关重要的作用。大多数哺乳动物细胞含有三种形式的 SOD，即SOD1、SOD2和SOD3，它们在细胞中有不同的定位：SOD1主要存在于细胞质和线粒体内膜间隙；SOD2主要分布在线粒体基质和内膜；SOD3在信号肽的引导下定位与细胞外间隙。在细胞外环境中，SOD3催化超氧阴离子的歧化，阻止O2‑
的形成，所以，SOD3在双氢青蒿素调控的免疫反应中是否发挥重要作用，是本领域技术人员一直渴望解决的技术难题。

技术实现思路

[0003]本专利技术针对上述现有技术中存在的问题，目的在于提供SOD3蛋白缺失在缓解双氢青蒿素诱导的脾增大及免疫细胞异质性方面的应用。
[0004]本专利技术的技术方案如下：
[0005]SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用。
[0006]所述的双氢青蒿素在调控脾脏增大及免疫细胞异质性的检测方法，包括如下步骤：
[0007]步骤1，将0.1g羧甲基纤维素钠(CMC
‑
Na)加入到20mL加热至100℃的蒸馏水中，在磁力搅拌器中搅拌3
‑
5h，当温度恢复至室温时，加入0.2g双氢青蒿素(DHA)，4℃避光连续搅拌10
‑
12h，得到双氢青蒿素溶液；
[0008]步骤2，给小鼠连续灌胃100mg/kg/d双氢青蒿素溶液26天后，取小鼠脾脏；
[0009]步骤3，将小鼠脾脏置于70μm的细胞筛上，细胞筛下面放置一个50mL的离心管，用注射器尾部带棱面研磨，同时加入预冷PBS冲洗，收集细胞悬液于 15mL的离心管中；
[0010]步骤4，上述步骤3中的细胞悬液1500rpm/min离心5min，吸去上清，留沉淀，用红细胞裂解液裂解红细胞，混匀后冰上静止3min；
[0011]步骤5，上述步骤4中裂解红细胞后的细胞悬液1500rpm/min离心5min，吸去上清，留沉淀，加入预冷5mL PBS重悬，洗涤3遍，从而制备双氢青蒿素诱导的免疫细胞亚群悬浊液；
[0012]步骤6，使用荧光显微镜及血球计数板计算小鼠脾脏免疫细胞数量；
[0013]步骤7，使用流式细胞术及单细胞转录组测序方法测定双氢青蒿素诱导的免疫细胞亚群的异质性。
[0014]所述的小鼠选体重18
‑
20g的健康雌性BALB/c小鼠，所有小鼠均饲养于无特定微生物的小动物房中，保持黑暗12小时和光照12小时。
[0015]所述的步骤4中，红细胞裂解液为155mM NH 4Cl，10mM KHCO3，0.11mMEDTA.Na2，pH 7.2。
[0016]所述的步骤7中，使用流式细胞术测定双氢青蒿素溶液诱导的免疫细胞亚群的方法，包括下述步骤：
[0017](1)将所获得的脾脏单细胞悬浮在含有0.04％BSA的PBS中；
[0018](2)制备不同组合的流式抗体组合，流式抗体组合如下：
[0019]①
第一组抗体，7AAD、抗CD45
‑
pacific blue抗体、抗CD3
‑
PE抗体、抗 CD4
‑
APC/Fire
TM
750抗体、抗CD8a
‑
FITC抗体、抗CD19
‑
BV510抗体、抗 CD45R/B220
‑
APC抗体；
[0020]②
第二组抗体，7AAD、抗CD45
‑
pacific blue抗体、抗CD11b
‑
APC抗体、抗 Ly
‑
6G/Ly
‑
6C(Gr
‑
1)
‑
FITC抗体；
[0021](3)将待测样本分别加入到流式管A和B中，使呈单个细胞悬液状态，并保证细胞量1
×
10 6/管
‑1×
10 7/管；所述待测样本为脾脏；
[0022](4)向步骤(3)处理得到的流式管A中加入本专利技术所述的试剂组合物中的第一组抗体，向步骤(3)处理得到的流式管B中加入本专利技术所述的试剂组合物中的第二组抗体，各流式管4度条件下避光孵育30分钟；
[0023](5)孵育结束后，向步骤(4)每管加入700μL PBS，混匀，1500rpm/min 离心5min，洗涤2次，吸去上清，留沉淀；
[0024](6)向步骤(5)去上清后的流式管中，分别加入PBS缓冲液洗涤，离心后去上清，用PBS缓冲液重悬细胞，即得到流式细胞上机样品。
[0025]所述的步骤7中，使用单细胞方法测定双氢青蒿素诱导的免疫细胞亚群的方法，包括细胞捕获和cDNA合成，具体步骤如下：
[0026](1)将所获得的脾脏单细胞悬浮在含有0.04％BSA的PBS中；
[0027](2)在芯片的每个通道加入约6,000个细胞，预计回收的目标细胞约为3,000 个细胞；
[0028](3)捕获的细胞被裂解，释放的RNA在单个GEM中通过逆转录进行条形码标记；
[0029](4)逆转录在S1000TM Touch Thermal Cycler(Bio Rad)上在53℃下进行45分钟，然后在85℃，5分钟，在结束后保持在4℃；
[0030]生成的cDNA在安捷伦4200分光光度计中确定质量。
[0031]本专利技术的优点效果如下：
[0032]使用荧光显微镜及血球计数板计算小鼠脾脏免疫细胞数量，发现双氢青蒿素灌胃可显著提高小鼠脾脏免疫细胞数；使用流式细胞术及单细胞转录组测序技术解析双氢青蒿素诱导的脾脏免疫细胞亚群悬浊液成分，为研究青蒿素对机体的免疫调节作用奠定了基础。
[0033]本专利技术的意义在于：双氢青蒿素可诱导小鼠脾脏增大，脾脏免疫细胞亚群中 CD11b
+
Gr
‑1+
中性粒细胞和B220
+
B细胞的比例显着增加，CD3
+
CD4
+
和 CD3
+
CD8
+
T细胞的比例
显着降低，绝对计数显示双高清青蒿素处理的小鼠脾脏中CD11b
+
Gr
‑1+
中性粒细胞、B220
+
B细胞、CD3...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用。2.根据权利要求1所述的SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用，其特征在于所述的双氢青蒿素在调控脾脏增大及免疫细胞异质性的检测方法，包括如下步骤：步骤1，将0.1 g羧甲基纤维素钠（CMC
‑
Na）加入到20 mL加热至100℃的蒸馏水中，在磁力搅拌器中搅拌3
‑
5 h，当温度恢复至室温时，加入0.2 g 双氢青蒿素（DHA），4℃避光连续搅拌10
‑
12h，得到双氢青蒿素溶液；步骤2，给小鼠连续灌胃100mg/kg/d双氢青蒿素溶液26天后，取小鼠脾脏；步骤3，将小鼠脾脏置于70 μm的细胞筛上，细胞筛下面放置一个50 mL的离心管，用注射器尾部带棱面研磨，同时加入预冷PBS冲洗，收集细胞悬液于15 mL的离心管中；步骤4，上述步骤3中的细胞悬液1500 rpm/min离心5 min，吸去上清，留沉淀，用红细胞裂解液裂解红细胞，混匀后冰上静止3 min；步骤5，上述步骤4中裂解红细胞后的细胞悬液1500 rpm/min离心5 min，吸去上清，留沉淀，加入预冷5 mL PBS重悬，洗涤3遍，从而制备双氢青蒿素诱导的免疫细胞亚群悬浊液；步骤6，使用荧光显微镜及血球计数板计算小鼠脾脏免疫细胞数量；步骤7，使用流式细胞术及单细胞转录组测序方法测定双氢青蒿素诱导的免疫细胞亚群的异质性。3.根据权利要求2所述的SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用，其特征在于所述的小鼠选体重18
‑
20g的健康雌性BALB/c小鼠，所有小鼠均饲养于无特定微生物的小动物房中，保持黑暗12小时和光照12小时。4.根据权利要求2所述的SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用，其特征在于所述的步骤4中，红细胞裂解液为155 mM NH 4Cl，10 mM KHCO3，0.11 mM EDTA.Na2，pH 7.2。5.根据权利要求2所述的SOD3在调控双氢青蒿素诱导的脾脏增大及免疫细胞异质性药物筛选或疫苗评价中的应用，其特征在于所述的步骤7中，使用流式细胞术测定双氢青蒿素溶液诱导的免疫细胞亚群的方法，包括下述步骤：（1）将所获得的脾脏单细胞悬浮在含有 0.04% BSA 的 PBS 中；（2）制备不同组合的流式抗体组合，流式抗体组合如下：第一组抗体，7AA...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈启军，姜宁，张义伟，李其龙，陈冉，冯颖，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：