一种表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株、其构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法，是以Schizochytrium sp.HX

【技术实现步骤摘要】
一种表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株、其构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及裂殖壶菌基因工程菌株，具体地说是一种表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株、其构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)属于ω
‑
3系多不饱和脂肪酸，是人体内的微量生物活性物质和必需的高度不饱和脂肪酸。EPA具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激、稳定斑块、稳定细胞膜及降低心血管疾病风险等作用，是重要的辅助治疗药物和保健品原料。
[0003]目前市场上高纯度的EPA主要来源于深海鱼油，但是从深海鱼油中提取EPA具有诸多缺点:
[0004](1)受季节和产地限制，鱼类数量和其中EPA的产量和品质皆不稳定；
[0005](2)因生态环境恶化，海洋污染日益严重，污染物通过鱼油进入人体内，对人体的健康存在安全隐患；
[0006](3)从鱼油中提取的EPA腥味重，不易为消费者所接受；
[0007](4)纯化成本较高，产品价格昂贵。
[0008]因此，从海洋鱼类中获取EPA这一途径，无论是市场需求总量还是鱼油产品的质量，都无法满足广大消费者的要求。
[0009]利用微生物生产EPA具有周期短、不受季节限制、可大规模生产、发酵所用的材料来源广泛、价格低廉等优势，因此引起了广大研究人员的兴趣。目前，能够实现EPA商业化生产的海洋微生物并不多。裂殖壶菌(Schizochytrium)相较于大肠杆菌、酵母以及微藻等微生物菌种，因具有生物量高、胞内油脂含量高和发酵条件简单易控等天然的PUFAs(多不饱和脂肪酸)合成优势而受到广泛关注，但裂殖壶菌合成EPA含量极低。
[0010]希瓦氏菌(Shewanella)在低温、高压条件下生长时，EPA作为细胞内唯一的PUFA产物，含量可达20％左右，希瓦氏菌中的PKS(polyketides，聚酮合酶)基因簇被认为催化合成EPA的主要基因。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的，旨在要提供一种异源表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株，为应用裂殖壶菌商业化生产EPA提供有效途径；
[0012]本专利技术的另一目的，旨在要提供上述的一种表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株构建方法，以达到对该菌株简便、快速、有效、精准构建的目标；
[0013]本专利技术还有一个目的，旨在要提供上述的一种表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株的一种应用，以实现生产周期短、不受季节限制、顾客接受度高、成本相对低廉、更健康地合成EPA的目的。
[0014]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0015]一种表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株，它是以裂殖壶菌为出发菌株，表达希瓦氏菌中的EPA合酶基因。
[0016]作为对专利技术的一种限定，所述裂殖壶菌为Schizochytrium sp.HX
‑
308，所述希瓦氏菌为Shewanella japonica。
[0017]作为对本专利技术的另一种限定，所述希瓦氏菌EPA合酶基因包括pfaA基因、pfaB基因、pfaC基因和pfaD基因；其中：
[0018]①
所述pfaA基因序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
[0019]atgagccaagcccctacaaatcctgagacaagctctcaagataataacgagtcgcaagatacaagactgaataaacgtcttaaagacatgcccattgccattgtcggcatggccagtatctttgccaactctcgttacctgaataagttttgggacttaatcagcgaaaaaattgatgctattaccgaagtacctgatacccactggcgcgctgaagattactttgatgctgacaagagcaccccagataagagctactgtaaacgcggtggttttatccctgaagtggactttaacccaatggaatttggcctgccgccaaatatcctagaactgaccgatacttcgcaattattgtcattagtgattgccaaagaagtgctagcagatgctggtgtcacttctgaatatgacactgataaaatcggtattactttaggtgtgggcggtggccaaaaaattaatgccagcctaacagcacgtctgcaataccctgtgcttaaaaaagtatttaaaagcagcggcctaagcgatgccgacagcgacatgcttatcaaaaaattccaagaccaatacattcactgggaagaaaactcgttcccaggatcgcttggtaatgttattgctggtcgtattgctaaccgctttgacttaggcggcatgaactgtgtggttgatgcggcatgtgcaggttcacttgcggcaatgcgtatggcgttaaccgaactggttgaaggccgcagcgaaatgatgatcactggtggcgtatgtaccgataactcgccatcgatgtacatgagtttttcaaaaaccccagcgtttaccaccaatgaaacgattcagccatttgatatcgactcaaaaggcatgatgattggtgaaggcattggcatggtggcattaaaacgtcttgaagatgctgagcgtgacggtgaccgtatttactcagtcattaaaggggtcggcgcttcatctgatggtaagttcaaatcaatttatgcacctcgacctgaaggccaagctaaagcgctgaagcgtgcttatgatgacgccggctttgcacctgaaaccgttggcttaattgaagctcacggaacaggcactgcagcgggtgatgtggcagaatttaatggtcttaaatctgtatttggtgagaatgactcaacaaagcaacacattgctttaggttcagttaagtcacaagtgggccatactaaatcaactgcgggaaccgcgggtgtgattaaagcggcgttagcactgcatcataaagtgctgccgccaaccatcaacgtctctaagcctaaccctaagcttaatgttgaggattcaccgtttttcattaacactgaaactcgcccttggatgcctcgccctgatggcacaccacgccgagctggtataagttcgttcggttttggtggcacaaacttccacttagtactagaagaatacagcccagagcacagccgtgatgagaaatatcgtcagcgccaagtagcacaaagcttattgattagcgctgacaataaagctg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株，其特征在于，它是以裂殖壶菌为出发菌株，表达希瓦氏菌中的EPA合酶基因。2.根据权利要求1所述的一种表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株，其特征在于，所述裂殖壶菌为Schizochytrium sp.HX
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308，所述希瓦氏菌为Shewanella japonica。3.根据权利要求1或2所述的一种表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株，其特征在于，所述希瓦氏菌中的EPA合酶基因包括pfaA基因、pfaB基因、pfaC基因和pfaD基因；其中：所述pfaA基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述pfaB基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述pfaC基因序列如SEQ ID NO.3所示；所述pfaD基因序列如SEQ ID NO.4所示。4.一种表达EPA合酶基因的裂殖壶菌基因工程菌株的一种构建方法，其特征在于，该构建方法包括依次进行的以下步骤：S1.重组质粒pfaAB
‑
pzpk
‑
NeoR
‑
TE的构建以pzpk
‑
NeoR质粒为骨架，在该质粒骨架上插入pfaA表达盒和pfaB表达盒，即得重组质粒pfaAB
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pzpk
‑
NeoR
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TE；S2.重组质粒pfaCD
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pCTS
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BleoR
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TE的构建以pzpk
‑
BleoR质粒为骨架，在该质粒骨架上插入pfaC表达盒和pfaD表达盒，即得重组质粒pfaCD
‑
pCTS
‑
BleoR
‑
TE；S3.表达EPA合酶基因裂殖壶菌基因工程菌株的构建将重组质粒pfaAB
‑
pzpk
‑
NeoR
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TE导入Schizochytrium sp.HX
‑
308细胞中得重组菌1；将重组质粒pfaCD
‑
pCTS
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，贾雨雷，孙小曼，农枋潼，黄鹏伟，马旺，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：