保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法技术

本发明专利技术涉及保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法，属于氨基酸或多肽合成的质量控制技术领域。本发明专利技术提供了保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法，采用阳离子交换柱分离和柱后茚三酮衍生光度法测定，所述阳离子交换柱为锂离子交换色谱柱，流动相依次采用缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4进行洗脱。采用本发明专利技术提供的分离检测方法可以对化学合成多肽起始物料中氨基酸类似物杂质进行有效控制，填补了化学合成多肽起始物料对该类杂质控制的空白。物料对该类杂质控制的空白。物料对该类杂质控制的空白。

【技术实现步骤摘要】
保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法


[0001]本专利技术涉及保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法，属于氨基酸或多肽合成的质量控制


技术介绍

[0002]保护氨基酸是化学合成多肽的通用起始物料，通常氨基酸的N端被保护基团所保护，一些氨基酸的侧链也有保护基团，如酪氨酸的侧链羟基，色氨酸的侧链吲哚基，组氨酸的侧链咪唑基，丝氨酸的侧链羟基，精氨酸的侧链胍基等，通常都需要保护起来。在化学合成多肽生产制造过程中，氨基酸的N端和部分侧链之所以需要保护起来，就是因为这些基团在未保护的情况下发生大量的副反应，消耗大量的起始物料、偶联试剂等，也产生大量的杂质，显著降低有效偶联反应，同时也增加后续纯化对杂质的去除难度和工艺时长，极度降低产品收率，甚至得不到合格的原料药产品。副反应的产生的杂质，随着多肽偶联反应的进行，每一步都会衍生出新的副产物，所以杂质的数量会随着反应步骤呈指数形式增加。这众多的杂质，一旦出现在产品中，就可能对产品的有效性、安全性等方面产生影响，这也是各药审机构不仅格外关注产品中杂质还要求企业对起始物料进行严格控制的原因。就生产成本而言，副反应造成物料消耗增加，纯化工艺难度增加，车间占用时长的增加、产品收率严重下降，将大大提高生产成本。因此多肽原料药生产企业除了有满足法规强制要求外，从自身成本出发也必要对起始物料中的杂质严格控制。
[0003]保护氨基酸中的一类非常重要的杂质就是N端保护基团脱掉的杂质，该类杂质主要是游离氨基酸，但是部分保护氨基酸除了N端有保护，侧链也有保护基团，那么这类保护氨基酸就需要多控制一类N端保护基脱掉而侧链有保护基的杂质(本专利技术中有时称为N端游离侧链保护的氨基酸，或简称为氨基酸类似物)。对于游离氨基酸的检测，检测方法种类众多，可以概括为经过衍生后通过液相色谱或者气相色谱分离，再采用紫外检测器、荧光检测或者质谱进行分析的柱前衍生方法，或者先经过离子交换色分离后再进行衍生检测的柱后衍生方法，还有非衍生的方法是经过特殊的柱分离后采用质谱检测。这些方法在蛋白质、多肽、营养液的氨基酸组分研究中多有应用，现行美国药典、欧洲药典等药典中均有相应通则，现行中国药典也有相应的通则公示稿。然而，针对N端游离侧链有保护基团的氨基酸类似物杂质的检测，目前还鲜有报道。对于保护氨基酸的质量控制，亟需更加全面地检测其中存在的杂质，进而提高杂质控制检测结果的准确性。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的目的在于提供保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法。
[0005]本专利技术提供了保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法，采用阳离子交换柱分离和柱后茚三酮衍生光度法测定，所述阳离子交换柱为锂离子交换色谱柱，流动相依次采用缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4进行洗脱，其中，缓冲液1的锂离子浓度
为0.27～0.35mol/L，pH值为2.8～3.1；缓冲液2的锂离子浓度为0.45～0.53mol/L，pH值为3.1～3.3；缓冲液3的锂离子浓度为0.85～1.0mol/L，pH值为3.45～3.5；缓冲液4的锂离子浓度为1.5～1.7mol/L，pH值为3.5～3.65。
[0006]进一步地，
[0007]每1L缓冲液1的配制方法为：取0.27～0.35mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至2.8～3.1；
[0008]每1L缓冲液2的配制方法为：取0.45～0.53mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.1～3.3；
[0009]每1L缓冲液3的配制方法为：取0.85～1.0mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.45～3.5；
[0010]每1L缓冲液4的配制方法为：取1.5～1.7mol的LiCl，0.08～0.11mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.5～3.65。
[0011]优选地，缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4中所述的醇溶剂各自独立选自异丙醇和/或甲醇。
[0012]进一步优选地，
[0013]每1L缓冲液1的配制方法为：取0.29～0.30mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.00～3.05；
[0014]每1L缓冲液2的配制方法为：取0.50～0.51mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.20～3.21；
[0015]每1L缓冲液3的配制方法为：取1.0mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.45～3.50；
[0016]每1L缓冲液4的配制方法为：取1.6～1.7mol的LiCl，0.10～0.11mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.5～3.6。
[0017]进一步地，流动相采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
[0018][0019][0020]优选地，梯度洗脱程序如下：
[0021]序号时间(min)流动相柱温℃10
‑
5缓冲液13425
‑
13缓冲液234313
‑
24缓冲液334424
‑
40缓冲液445540
‑
70缓冲液495
[0022]进一步地，所述阳离子交换柱以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂。
[0023]优选地，所述阳离子交换柱为Ultropac 8阳离子交换柱或LCA K07阳离子交换柱。
[0024]优选地，所述阳离子交换柱的规格为150mm
×
4.6mm，粒径5～10μm。
[0025]进一步优选地，所述阳离子交换柱的粒径为7～8μm。
[0026]进一步优选地，所述阳离子交换柱的粒径为7μm。
[0027]进一步地，所述分离检测方法包括用上样溶剂上样的步骤，所述上样溶剂的锂离子浓度为0.15～0.23mol/L，pH值为2.0～2.3。
[0028]优选地，每1L上样溶剂的配制方法为：取0.15～0.23mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，加水至1L，然后调节pH至2.0～2.3。
[0029]进一步优选地，每1L上样溶剂的配制方法为：取0.20～0.22mol的LiCl，0.04～0.05mol的柠檬酸，加水至1L，然后调节pH至2.1～2.2。
[0030]进一步地，所述缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4、上样溶剂各自独立地选用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.保护氨基酸与其N端脱掉保护基的杂质的分离检测方法，其特征是：采用阳离子交换柱分离和柱后茚三酮衍生光度法测定，所述阳离子交换柱为锂离子交换色谱柱，流动相依次采用缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4进行洗脱，其中，缓冲液1的锂离子浓度为0.27～0.35mol/L，pH值为2.8～3.1；缓冲液2的锂离子浓度为0.45～0.53mol/L，pH值为3.1～3.3；缓冲液3的锂离子浓度为0.85～1.0mol/L，pH值为3.45～3.5；缓冲液4的锂离子浓度为1.5～1.7mol/L，pH值为3.5～3.65。2.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：每1L缓冲液1的配制方法为：取0.27～0.35mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至2.8～3.1；每1L缓冲液2的配制方法为：取0.45～0.53mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.1～3.3；每1L缓冲液3的配制方法为：取0.85～1.0mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.45～3.5；每1L缓冲液4的配制方法为：取1.5～1.7mol的LiCl，0.08～0.11mol的柠檬酸和/或磷酸，醇溶剂10～50ml，加水至1L，然后调节pH至3.5～3.65；优选地，缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4中所述的醇溶剂各自独立选自异丙醇和/或甲醇；进一步优选地，每1L缓冲液1的配制方法为：取0.29～0.30mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.00～3.05；每1L缓冲液2的配制方法为：取0.50～0.51mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.20～3.21；每1L缓冲液3的配制方法为：取1.0mol的LiCl，0.05～0.06mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.45～3.50；每1L缓冲液4的配制方法为：取1.6～1.7mol的LiCl，0.10～0.11mol的柠檬酸，异丙醇15ml/甲醇50ml，加水至1L，然后调节pH至3.5～3.6。3.如权利要求1或2所述的分离检测方法，其特征是：流动相采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：序如下：优选地，梯度洗脱程序如下：序号时间(min)流动相柱温℃10
‑
5缓冲液134
25
‑
13缓冲液234313
‑
24缓冲液334424
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40缓冲液445540
‑
70缓冲液495。4.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：所述阳离子交换柱以锂离子型磺酸基强酸性阳离子交换树脂为填充剂；优选地，所述阳离子交换柱为Ultropac 8阳离子交换柱或LCA K07阳离子交换柱；优选地，所述阳离子交换柱的规格为150mm
×
4.6mm，粒径5～10μm；进一步优选地，所述阳离子交换柱的粒径为7～8μm；进一步优选地，所述阳离子交换柱的粒径为7μm。5.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是：包括用上样溶剂上样的步骤，所述上样溶剂的锂离子浓度为0.15～0.23mol/L，pH值为2.0～2.3；优选地，每1L上样溶剂的配制方法为：取0.15～0.23mol的LiCl，0.03～0.06mol的柠檬酸和/或磷酸，加水至1L，然后调节pH至2.0～2.3；进一步优选地，每1L上样溶剂的配制方法为：取0.20～0.22mol的LiCl，0.04～0.05mol的柠檬酸，加水至1L，然后调节pH至2.1～2.2。6.如权利要求1、2、5任意一项所述的分离检测方法，其特征是：所述缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3、缓冲液4、上样溶剂各自独立地选用LiOH和/或HCl调节pH值。7.如权利要求1所述的分离检测方法，其特征是...

【专利技术属性】
技术研发人员：何雄风，李科锐，龚诗雨，胡敏，张长清，胡和平，
申请(专利权)人：四川汇宇海玥医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：