一种生产维生素A的酿酒酵母菌及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种生产维生素A的酿酒酵母菌及其构建方法，属于发酵工程技术领域。本发明专利技术以酿酒酵母为出发菌株，在酵母细胞中构建维生素A合成途径，过表达酿酒酵母内源维生素A合成前体异戊二烯焦磷酸的甲羟戊酸途径，同时强化酿酒酵母外源类胡萝卜素合成途径关键基因表达，得到一种酿酒酵母基因工程菌。利用该酿酒酵母基因工程菌发酵生产维生素A,摇瓶产量可达到193.9mg/L，维生素A产量显著提升。维生素A产量显著提升。维生素A产量显著提升。

【技术实现步骤摘要】
一种生产维生素A的酿酒酵母菌及其构建方法


[0001]本专利技术涉及发酵工程
，尤其是指一种生产维生素A的酿酒酵母菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]维生素A(VitaminA，VA)，被称为“美容维生素”和“抗干眼病维生素”，是人体必需微量营养素，不能在体内合成，需要通过外源性的方式(主要是饮食)获得。维生素A的主要生物活性形式是视黄醇、视黄醛和视黄酸，其中视黄醇主要存在于动物肝脏中，是维生素A主要的天然存在形式。
[0003]维生素A可从动物组织中提取，但资源分散，步骤繁杂，成本高。目前，商品维生素A都是化学合成产品，关键中间体柠檬醛生产技术缺乏控制力，大多数维生素产业的上游中间体供应受制于巴斯夫、日本第一制药等国际维生素中间体供应商。不仅如此，化学合成维生素A步骤繁琐且技术门槛较高，容易生成有毒害的异构体，对能源的消耗较大。
[0004]通过合成生物学技术构建微生物细胞工厂，反应条件温和、选择专一性强，能够将糖类等可再生的生物资源转化为化学产品，替代化学合成，实现绿色清洁生产，可以摆脱对石油资源的依赖，解决石化制造过程中的高耗能和高污染问题。
[0005]酿酒酵母是异源合成天然产物的重要宿主，通过合成生物学和代谢工程对酿酒酵母中所具有的甲羟戊酸(MVA)途径进行改造，引入外源类胡萝卜素合成的相关基因，实现萜类物质维生素A的合成，但维生素A合成途径复杂内源类异戊二烯前体供应不足、外源类胡萝卜素途径相关限速酶表达量低仍然是维生素A合成过程中需要解决的问题。
[0006]鉴于上述原因，本专利技术人积极加以研究创新，以期通过生物合成方法构建高效生产维生素A的菌株，使其更具有产业上的利用价值，为生物合成维生素产业提供理论与实践参考。

技术实现思路

[0007]为此，本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术中酿酒酵母合成维生素A时存在的内源类异戊二烯前体供应不足、外源类胡萝卜素合成途径相关限速酶表达量低以及代谢途径复杂而导致产量实现不了突破等缺陷。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种生产维生素A的酿酒酵母菌及其构建方法，利用该酿酒酵母基因工程菌发酵生产维生素A，摇瓶产量可达到193.9mg/L，维生素A产量显著提升。
[0009]本专利技术采用的技术方案如下。
[0010]本专利技术提供了一种生产维生素A的酿酒酵母基因工程菌，所述基因工程菌以酿酒酵母为出发菌株，在酵母细胞中构建维生素A合成途径，和/或强化酿酒酵母维生素A合成的内源甲羟戊酸途径，和/或同时强化酿酒酵母外源类胡萝卜素合成途径关键基因表达。
[0011]在本专利技术的一个实施例中，所述基因工程菌以酿酒酵母BY4741为出发菌株。
[0012]在本专利技术的一个实施例中，所述在酵母细胞中构建维生素A合成途径是将外源的香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶)crtE、八氢番茄红素合酶crtB、八氢番茄红素去饱和酶crtI、番茄红素环化酶crtYB和β
‑
胡萝卜素15,15
′‑
单加氧酶BCMO编码基因整合到酿酒酵母基因组中。
[0013]优选地，所述crtE来源于曼地亚红豆杉(Taxus x media)。
[0014]优选地，所述crtB来源于成团泛菌(Pantoea agglomerans)。
[0015]优选地，所述crtI来源于三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)。
[0016]优选地，所述crtYB来源于红法夫酵母(Xanthophyllomyces Dendrorhous)。
[0017]优选地，所述BCMO来源于海洋细菌(uncultured marine bacterium)66A03。
[0018]在本专利技术的一个实施例中，所述强化酿酒酵母维生素A合成的内源甲羟戊酸途径包括：强化表达3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI、法尼基焦磷酸合酶ERG20、内质网大小调节因子的相关基因INO2、敲除ROX1基因和并且下调角鲨烯合酶ERG9的表达。
[0019]在本专利技术的一个实施例中，所述强化酿酒酵母外源类胡萝卜素合成途径关键基因为crtE、crtI时，采用双向诱导型启动子启动。
[0020]本专利技术还提供了一种生产维生素A的方法，包括以下步骤：
[0021](1)将上述酿酒酵母基因工程菌接种到种子培养基中进行种子培养；
[0022](2)将制备得到的种子液接种于发酵培养基，发酵培养60～120h，制备得到发酵液。
[0023]在本专利技术的一个实施例中，所述方法具体包括以下步骤：
[0024](1)将上述酿酒酵母基因工程菌在25～35℃，200～250rpm条件下培养16～24h，制备得到种子液；
[0025](2)将制备得到的种子液按1～5％(v/v)的接种量接种于发酵培养基；在25～35℃，200～250rpm条件下培养80～120h，制备得到发酵液。
[0026]优选地，种子培养基的成分包括：10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖。
[0027]优选地，发酵培养基的成分包括：25g/L葡萄糖、25g/L甘油、50g/L大豆蛋白胨、0.6g/L磷酸氢二钾、25g/L蔗糖。
[0028]优选地，在发酵培养基中还加入了十二烷，其中发酵培养基与十二烷的体积比是1：10
‑
1：1。由于产物维生素A是亲脂性产物，过量积累对细胞有毒害作用，而且胞内对亲脂性物质储存能力有限，所以加入十二烷的作用是将胞内的维生素A萃取到十二烷中，利于胞内后续产物的合成与积累。
[0029]本专利技术还提供了上述酿酒酵母基因工程菌在食品、化工或制药领域的应用。
[0030]本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0031]本专利技术提供了一种提高维生素A产量的基因工程菌及其构建方法与应用，该构建方法是以酿酒酵母BY4741为出发菌株，将外源的香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPP合酶，crtE)、八氢番茄红素合酶(crtB)、八氢番茄红素去饱和酶(crtI)、番茄红素环化酶(crtYB)和β
‑
胡萝卜素15,15
′‑
单加氧酶(BCMO)编码基因整合到酿酒酵母基因组中，在酵母细胞中构建维生素A合成途径，摇瓶发酵产量达到8.5mg/L。过表达酿酒酵母内源维生素A合成前体异戊二烯焦磷酸的甲羟戊酸(MVA)途径，其具体措施为强化表达3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶
A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI、法尼基焦磷酸合酶ERG20、内质网大小调节因子的相关基因INO2、敲除了ROX1基因和并且下调角鲨烯合酶ERG9的表达。使摇瓶发酵产量达到37.17mg/L。强化酿酒酵母外源类胡萝卜素合成途径关键基因crtE、crtI表达，并采用双向诱导型启动子启动，在保本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产维生素A的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以酿酒酵母为出发菌株，在酵母细胞中构建维生素A合成途径，和/或强化酿酒酵母维生素A合成的内源甲羟戊酸途径，和/或同时强化酿酒酵母外源类胡萝卜素合成途径关键基因表达。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述在酵母细胞中构建维生素A合成途径是将外源的香叶基香叶基二磷酸合酶crtE、八氢番茄红素合酶crtB、八氢番茄红素去饱和酶crtI、番茄红素环化酶crtYB和β
‑
胡萝卜素15,15
′‑
单加氧酶BCMO编码基因整合到酿酒酵母基因组中。3.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述强化酿酒酵母维生素A合成的内源甲羟戊酸途径包括：强化表达3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI、法尼基焦磷酸合酶ERG20、内质网大小调节因子的相关基因INO2、敲除ROX1基因和并且下调角鲨烯合酶ERG9的表达。4.根据权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述强化酿酒酵母外源类胡萝卜素合成途径关键基因为crtE、crtI时，采用双向诱导型启动子启动。5.根据权利要求1～4任...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，石勇，陈坚，石训，吕雪芹，张攀攀，堵国成，李江华，刘延峰，王静，王青霞，王璇，刘家恒，
申请(专利权)人：好想你健康食品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：