一种检测多个单核苷酸多态性的方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术公开了提供一种检测多个单核苷酸多态性的方法、试剂盒及其应用，属于基因检测技术领域，该方法主要包括：根据靶标基因序列，设计上游引物、下游引物和两条邻近单标记探针，配制多重PCR反应体系，采用引物对称扩增方式进行扩增，然后进行熔解曲线分析。本发明专利技术利用两条邻近单标记探针与靶标结合/解离状态下的荧光信号差异，增强区分SNP等位基因的能力，使多重PCR的判读更加清晰。本发明专利技术通过引物对称扩增+快速降温的方式获得单链扩增产物，能有效降低多重引物体系间的扩增效率差异，解决高GC模板扩增问题。本发明专利技术方法突破多个单核苷酸多态性检测的技术瓶颈，为临床提供一种结果稳定、判读简单、通量高、周期短、成本低的多重SNP检测方法。SNP检测方法。SNP检测方法。

【技术实现步骤摘要】
一种检测多个单核苷酸多态性的方法、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及核酸检测
，具体为一种检测多个单核苷酸多态性的方法、试剂盒 及其应用。

技术介绍

[0002]原发性高血压病是最常见的慢性疾病之一，是导致冠心病、脑卒中等心血管疾病的重 要危险因子，大量的研究证明，原发性高血压病主要受遗传因素和环境因素的共同影响。 目前临床常用的降压药物包括利尿剂、β肾上腺素受体阻滞剂、钙拮抗剂、ACE抑制剂、 血管紧张素II受体拮抗剂和α肾上腺素受体阻滞剂，然而，在临床治疗高血压的药物在个体 反应差异十分普遍，主要原因是由于与药物相关的药物代谢酶和受体发生了遗传变异。目 前市场上拿证的PCR类试剂盒及相关专利都需要通过至少3个反应管才能完成对高血压用 药相关基因CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE5个SNP基因多态性位点的检测， 检测成本高、检测效率低，限制了高血压精准用药的临床大规模推广。
[0003]目前对单核苷酸多态性的检测，常见的方法有直接测序法、基因芯片杂交法、 MALDI
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TOFMS质谱技术、PCR
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TaqmanMGB探针分型法、ARMS
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PCR法、PCR高分辨率 熔解曲线法等，这些方法在推广上都或多或少存在如试剂检测成本高，操作复杂，易产生 污染，产生一定假阴性和假阳性等缺陷。
[0004]直接测序法，是SNP位点分析的金标准，但该检测方法受到测序仪器的限制，测序仪 器昂贵，推广困难。另外直接测序对模板量要求高，通常需要通过PCR扩增富集目的片段 后，进行测序，操作复杂，周期长，且为开管操作，容易造成污染。
[0005]基因芯片杂交法，该检测方法仍然存在操作复杂，开管操作，易造成污染的问题，另 外杂交芯片制作复杂，需要载玻片等耗材，大大提高了检测成本。整个检测周期需要3
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4 个小时，效率不高。
[0006]MassARRAY核酸质谱技术检测速度快，理论上能分开单个碱基变化这种纯物理检测易 受到样本因素的多种干扰，精确度难以保证。检测过程需要多点质控，否则精确度很低。 另外，很重要的一点是这个检测PCR过程和质谱过程是分开的，PCR需要自己做，并不便 宜。
[0007]PCR
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Taqman MGB探针分型法，因其操作简单，分型准确，全程闭管操作，检测周期 短等特点，是目前比较主流的SNP分型方法。然而由于仪器采集信号通道的限制，每次反 应都只能检测有限几个SNP位点，通量较低，而采取多管检测的时候又会极大增加检测的 经济成本和时间成本；另外该技术需要两条Taqman
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MGB探针，而MGB探针的合成价格 是普通Taqman探针的几倍，大大增加了检测成本，且MGB探针属于美国LIFE公司专利 技术，会在原材料上受到较多限制。
[0008]ARMS
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PCR，扩增阻滞突变系统PCR，又称为等位基因特异性PCR，用于对已知突变 基因进行检测。ARMS
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PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位 基因特异性引物的3
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末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。目前市场主 流
为ARMS+qPCR技术，采用TaqMan探针进行检测。该技术具有操作简单，时间快速， 灵敏度高，可检测低至1％的突变，成本较低(LDT)，缺点是检测通量较低，不能检测未 知突变，另外结果判读复杂，需要在qPCR上通过CT值进行判断，同时不适于位点附近 GC含量过高或过低的SNP的分型检测。
[0009]HRM(HighResolutionMelting)PCR高分辨率熔解曲线SNP分型检测技术的主要原理是 根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进 行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。该技术 能高通量检测基因的突变情况，且试剂成本低，只需要普通的饱和荧光染料，而不需要特 定探针，但是由于SNP位点仅仅为一个碱基的变异，因此检测仪器通常比普通的荧光PCR 仪更为精密，对于温度敏感性要求特别高，两个不同碱基的变异，熔解温度可能仅仅相差 0.2
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0.6℃，稍有不慎，或者仪器不稳定，则很难进行区分，因此受到仪器的影响很大因此 普及受到限制。
[0010]基于双标记自淬灭Taqman探针或分子信标的熔解曲线分析方法的应用较为广泛，此类 方法通过探针与扩增产物的杂交温度差异来区分不同的基因型。然而，这些方法均有一定 的局限性，TaqMan探针在杂交状态和游离状态下的信号差异较小，尤其是当探针长度较长 时，这种信号差异更小，很难与背景信号区分。
[0011]传统的PCR熔解曲线技术的技术原理多是获得单链产物，随后探针与单链产物形成熔 解曲线进行靶序列的信息分析，该技术在应用于多重PCR扩增时，同一反应孔中不同靶序 列的扩增效率不一致，特别是高GC模板扩增问题，存在相互竞争抑制，使产生的不同靶 序列单链产物拷贝数不一致，导致同一反应孔中不同靶序列的检测灵敏度明显不同，限制 了基因位点检测通量。
[0012]因此，急需建立一种简单易行且可以同时检测多个单核苷酸多态性的检测方法，从而 提高检测效率，为临床应用提供服务。

技术实现思路

[0013]本专利技术的目的在于：提供一种检测多个单核苷酸多态性的方法及应用，能够提高检测 效率，节约检测成本。
[0014]本专利技术还提供一种检测多个单核苷酸多态性的试剂盒，用于高血压用药相关基因的检 测，可以快速准确地检测高血压用药相关基因的多态性，并为临床选择合适的药物种类及 药物剂量提供相关遗传学证据，提高药物使用的安全性和有效性。
[0015]本专利技术采用的技术方案如下：
[0016]一种检测多个单核苷酸多态性的方法，包括如下步骤：
[0017]S1：根据靶标基因位点序列，分别设计每种所述靶标基因位点的特异性上游引物、下 游引物和探针序列；针对每个靶标基因设计两条邻近单标记探针，即一条3
’
端标记淬灭基 团的探针P1，另一条邻近的5
’
端标记荧光基团且3
’
端磷酸化封闭处理的探针P2，且探针 P1的长度长于探针P2。
[0018]S2：配制多重PCR反应体系，所述多重PCR反应体系包括每种靶标基因的特异性探 针、每种靶标基因的特异性上游引物和下游引物，其中，上游引物与下游引物浓度相同。
[0019]S3：进行PCR对称扩增，在PCR扩增周期结束后，进行熔解曲线分析，根据熔解峰 Tm
值的差异及荧光通道类型判断单核苷酸的基因型。
[0020]优选的，步骤S1中，所述单标记探针P1序列长度介于23～30bp，Tm值介于50～75
°
；单标记探针P2序列长度介于15～25bp，Tm值介于45～70
°
。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测多个单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：根据靶标基因位点序列，分别设计每种所述靶标基因位点的特异性上游引物、下游引物和探针序列；针对每个靶标基因设计两条邻近单标记探针，即一条3
’
端标记淬灭基团的探针P1，另一条邻近的5
’
端标记荧光基团且3
’
端磷酸化封闭处理的探针P2，且探针P1的长度长于探针P2；S2：配制多重PCR反应体系，所述多重PCR反应体系包括每种靶标基因的特异性探针、每种靶标基因的特异性上游引物和下游引物，其中，上游引物与下游引物浓度相同；S3：进行PCR对称扩增，在PCR扩增周期结束后，进行熔解曲线分析，根据熔解峰Tm值的差异及荧光通道类型判断单核苷酸的基因型。2.根据权利要求1所述的一种检测多个单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤S1中，所述单标记探针P1序列长度介于23～30bp，Tm值介于50～75
°
；单标记探针P2序列长度介于15～25bp，Tm值介于45～70
°
。3.根据权利要求1所述的一种检测多个单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、ROX、CY5，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3。4.根据权利要求1～3任一所述的一种检测多个单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤S2中，多重PCR反应体系中引物、探针的用量比例为：上游引物：下游引物：单标记探针P1：单标记探针P2＝4：4：2：1。5.根据权利要求1～3任一所述的一种检测多个单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤S3中，基于引物对称扩增的方式获得双链扩增产物，通过快速降温的方式获得单链杂交产物，降温速率介于0.1℃/s～4℃/s，熔解曲线程序为：95℃保持1min，43℃～73℃升温并以0.04℃/s～0.06℃/s的升温速度采集荧光信号。6.一种检测多个单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于高血压用药相关基因的检测，包含下述1)～5）中5组引物探针组合：1）检测ACE（rs4646994）的引物SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2及探针序列SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12，其中SEQ ID NO.11所示探针的...

【专利技术属性】
技术研发人员：童京京，赵瑞瑞，刘勋，刘瑞娜，李博茹，
申请(专利权)人：郑州华之源医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：