一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用，所述融合基因中含有大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原优化基因、连接序列和标签序列。基于其制备得到的重组乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000 pNZ8148

【技术实现步骤摘要】
一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用.

技术介绍

[0002]大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass ranavirus，LMBV)为虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员，是一种胞质型双链大DNA病毒。LMBV在两栖类、禽类等天然宿主体内，甚至鱼饵中均可以存活，存在多种传播途径，目前没有有效的治疗药物，只能靠科学饲养和及时消毒来预防。这类蛙病毒病夏季高发，发病时水温为25～30℃，会害成鱼，鱼类感染致死率高。
[0003]大口黑鲈(Micropterus Salmoides)，又名加州鲈，是一种重要的淡水养殖鱼类品种，生长速度快且对环境适应强。大口黑鲈年产量高，据统计，年产量突破约60万吨，是中国当前年产量最大的特种淡水鱼类之一，经济效益显著。但随着养殖规模不断增加，大口黑鲈病害问题也日益严重，特别是病毒类疾病，导致大口黑鲈苗种和成鱼出现大规模爆发性死亡，造成巨大的经济损失。近年来，随着研究人员先后从大口黑鲈病鱼分离到大口黑鲈虹彩病毒，证明了LMBV是引起大口黑鲈死亡的主要病原之一。而该病毒病的防治方法只有通过疫苗等免疫制品来预防。疫苗具有无残留、不易引起耐药性、安全高效等优点，作为大口黑鲈虹彩病毒病防控的重要途径，是加州鲈病害防控的发展趋势。
[0004]因此，开发一种能够有效预防或治疗大口黑鲈虹彩病毒的产品对于大口黑鲈的养殖以及大口黑鲈虹彩病毒病的防控具有极为重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种融合基因、其所编码的蛋白及其在鱼类虹彩病毒口服疫苗的应用。本专利技术以乳酸菌L.lactis NZ9000 作为表达宿主，pNZ8148作为表达载体，通过对大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP抗原基因进行密码子优化并连接usp45短肽序列，制备得到了使用效果优异的活载体疫苗L.lactisNZ9000 pNZ8148
‑
usp45
‑
mcp。该疫苗投喂大口黑鲈，口服免疫效果优异，为大口黑鲈虹彩病毒口服疫苗的研究提供了新的思路。
[0006]本专利技术的第一个方面，提供一种大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP抗原优化基因。
[0007]大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein，MCP)是决定大口黑鲈虹彩病毒毒力的主要蛋白，也是开发各种大口黑鲈虹彩病毒疫苗的关键抗原蛋白。
[0008]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述优化基因的核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示。
[0009]专利技术人对于大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原基因做了优化，提高大口黑鲈虹
彩病毒 MCP抗原基因中对应氨基酸乳酸乳球菌中高频密码子，减少低频密码子。该优化在不改变大口黑鲈虹彩病毒MCP抗原基因序列的基础上，经过密码子优化设计，可以大幅度提高重组大口黑鲈虹彩病毒MCP抗原基因的表达量，优化的序列与原序列的序列对比如说明书附图图1 所示。
[0010]本专利技术的第二个方面，提供一种融合基因，该融合基因中含有本专利技术第一个方面所述的大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原优化基因。
[0011]根据本专利技术的第二个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述融合基因还包含连接序列和标签序列。
[0012]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述连接序列包括Usp45短肽序列。
[0013]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述标签序列包括His标签。
[0014]当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择不加入标签序列或使用其他标签或标志物，以实现验证表达的成功与否的使用效果。
[0015]在本专利技术的一些更优选实施方式中，所述融合基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示。
[0016]本专利技术中的融合基因是基于密码子优化的虹彩病毒主要衣壳蛋白，加上usp45短肽序列 (标签序列仅用于验证表达的成功与否)得到的，以此得到的融合蛋白可作为大口黑鲈口服疫苗使用，通过添加口服佐剂，通过饲料投喂大口黑鲈，经感染评价、免疫保护效果评价、检测血液中抗体滴度的变化情况和荧光定量测定IgM抗体的变化情况等方法，充分验证了该口服疫苗的有效性和优异性。
[0017]本专利技术的第三个方面，提供本专利技术第二个方面所述的融合基因所编码的融合蛋白。
[0018]本专利技术的第四个方面，提供含有本专利技术第一个方面所述优化基因、本专利技术第二个方面所述的融合基因或本专利技术第三个方面所述的融合蛋白的产品。
[0019]根据本专利技术的第四个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述产品包括重组表达载体、表达盒或转基因细胞系。
[0020]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述载体为pNZ8148。
[0021]pNZ8148载体是乳酸菌表达载体，其具有最有效的食品诱导表达系统，即乳链菌肽诱导的基因表达系统(Nisin
‑
Controlld Expression System，NICE)。NICE系统有高效表达细菌、病毒抗原和一些毒性蛋白的能力，同时更具有安全性高、价格成本低、通用性等的优点。而且， NICE系统表达诱导物Nisin，是一种生物安全肽,对人体无毒副作用，其进入消化道后被对应的蛋白酶作用从而失活，所以不会影响肠道的菌群平衡，是可作为天然安全的保鲜剂应用在食品工业中。以上优势使得乳酸菌能够作为食用性疫苗的传递载体。
[0022]而且，表达诱导物Nisin对革兰氏阳性菌有一定抑制作用，高浓度使用可能会伤害宿主菌而导致蛋白表达量下降，通常使用亚致死剂量诱导NlCE系统中目标蛋白的表达。在本专利技术中，使用的Nisin浓度是10ng/mL，诱导时间为4h，通过western
‑
blot结果分析，具有较好的表达效果。
[0023]本专利技术的第五个方面，提供一种转基因重组菌，该转基因重组菌含有下述(1)～(3)中的至少一种：
[0024](1)本专利技术第一个方面所述优化基因；
[0025](2)本专利技术第二个方面所述的融合基因；
[0026](3)本专利技术第三个方面所述的融合蛋白。
[0027]根据本专利技术的第五个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述转基因重组菌为转基因重组乳酸乳球菌。
[0028]乳酸菌是人、动物和鱼的肠道微生物组成成分，为普遍公认的安全菌株，应用于食品工业中，作为表达系统的宿主菌相比其他微生物有天然优势。
[0029]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述重组乳酸乳球菌为Lactococcus lactis NZ9000 pNZ8148
‑
MCP，于2021年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址位于：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原优化基因，其特征在于，所述优化基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因中含有权利要求1中所述的大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白MCP抗原优化基因。3.根据权利要求2所述的融合基因，其特征在于，所述融合基因还包含连接序列和标签序列。4.根据权利要求3所述的融合基因，其特征在于，所述连接序列包括Usp45短肽序列；所述标签序列包括His标签；所述融合基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示。5.权利要求4所述的融合基因所编码的融合蛋白。6.含有如权利要求1所述优化基因、权利要求2
‑
4任一项所述的融合基因或权利要求5所述的融合蛋白的产品；所述产品优选包括重组表达载体、表达盒或转基因细胞系。7.一种转基因重组菌，其特征在于，所述转基因重组菌含有权利要求1所述优化基因、权利要求2
‑
4任一项所述的融合基因或权利要求5所述的融合蛋白中的至少一种；所述转基因重组菌优选为转基因重...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖迎迢，黄志斌，巩华，陶家发，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：