用于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物及所述简并引物的应用制造技术

本发明专利技术提供用于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物，还提供一种利用简并引物扩增微生物醇脱氢酶基因片段的检测方法，首先提取待测样品微生物总DNA作为模板，用简并引物进行PCR扩增，纯化后进行高通量测序，通过获取测序结果是否含有醇脱氢酶和GroES

【技术实现步骤摘要】
用于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物及所述简并引物的应用


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种用于扩增微生物醇 脱氢酶基因片段的简并引物和检测方法，还涉及应用所述引物检测大 曲中潜在产高级醇微生物丰度的方法。

技术介绍

[0002]高级醇(碳原子数大于2的醇类)，具有醇甜和助香功能，同时也 是形成酯类和醛类等风味物质的重要前体，在传统发酵食品风味物质 组成中占有重要地位。但当高级醇含量过高时不仅会导致风味异常， 甚至会造成健康风险。
[0003]确定多种微生物参与的混合微生物发酵过程中，具有高级醇生产 能力的微生物，进而通过配比、选择适合种子(曲)发酵是控制发酵 食品中高级醇含量的有效方法。但是，目前基于微生物多样性的关联 分析方法不能建立高级醇与微生物之间的直接联系。
[0004]代谢途径中的功能基因可用作标记基因，不仅可以表征群落代谢 功能，还能进一步研究混合微生物中潜在的代谢产物生产者。根据现 有微生物高级醇代谢途径来看醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase， ADHs)在微生物高级醇代谢过程中非常关键(图1)。通过设计简并 引物扩增菌种(曲)中微生物醇脱氢酶基因片段，利用高通量测序技 术获取序列信息，进一步利用生物信息学技术分析潜在产高级醇微生 物确定菌种配比，保证产品质量。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术在分析潜在产高级醇微生物方面的 空白，提出能够扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物，并基于该 简并引物实现潜在产高级醇微生物丰度的检测。
[0006]针对上述目的，本专利技术提供用于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的 简并引物，所述引物包括：
[0007]L.ADHs
‑
F：5
′
ATAGAATACTGCGGCgtntgyca3
′
[0008]L.ADHs
‑
R：5
′
TTTGTACGCTGTTACnccngcrca3
′
[0009]基于上述引物，本专利技术还提供一种利用简并引物扩增微生物醇脱 氢酶基因片段的检测方法，所述方法包括以下步骤：
[0010](1)提取待测样品微生物总DNA；
[0011](2)以步骤(1)中微生物总DNA为模板，用上述简并引物进 行PCR扩增反应，获得扩增产物A1；
[0012](3)将扩增产物A1纯化获得纯化扩增产物B1；
[0013](4)将纯化扩增产物B1进行高通量测序，通过获取测序结果是 否含有醇脱氢酶和GroES
‑
like蛋白的操作分类单元判断待 测样品微生物中是否含有醇脱氢酶。
[0014]在本专利技术中，所述醇脱氢酶是锌依赖长链醇脱氢酶，是微生物高级 醇代谢途径中
的关键酶，负责醇与醛之间的转化。
[0015]进一步地，步骤(4)中所述分析并判断结果的方法为：
[0016]高用量测序结果经FLASH拼接后，使用Usearch以95％～100％相 似度对测序结果进行操作分类单元(OTU)划分，OTU代表性序列与 Non
‑
redundant protein(nr)数据库进行Basic Local Alignment Search Tool (blastx)比对并注释OTU代表性序列的蛋白信息，注释信息中含有 Alcohol dehydrogenase和GroES
‑
like protein的OTU即为醇脱氢酶基因 OTU。
[0017]其中，步骤(2)的引物为：
[0018]L.ADHs
‑
F：5
′
ATAGAATACTGCGGCgtntgyca3
′
[0019]L.ADHs
‑
R：5
′
TTTGTACGCTGTTACnccngcrca3
′
[0020]步骤(2)的PCR扩增反应条件为：
[0021]PCR扩增程序为：94℃
‑
95℃预变性3
‑
5min，94℃
‑
95℃变性30s
‑ꢀ
60s，55℃
‑
60℃退火30s
‑
60s，72℃延伸30s
‑
60s，循环数为30
‑
35个， 72℃最后延伸10min。
[0022]作为一种优选的实施方式，所述待测样品是大曲，本专利技术的检测 方法可用于检测如大曲等混合微生物样品中是否有含有醇脱氢酶的微 生物。
[0023]本专利技术从醇脱氢酶氨基酸的结构域出发，挑选了多条醇脱氢酶氨 基酸序列，通过Bioedit中ClusterW进行对比后，设计出本专利技术的用 于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物。采用Basic LocalAlignment Search Tool(blastx)与Non
‑
redundant protein(nr)数据库 进行比对并注释扩增产物的信息，确定醇脱氢酶基因进而确定检测样 品中含潜在产高级醇微生物种类及丰度大小，从而为样品中潜在产高 级醇微生物组成的进一步研究奠定基础。
【附图说明】
[0024]图1为醇脱氢酶(ADHs)在微生物高级醇代谢过程中的作用；
[0025]图2为醇脱氢酶(L.ADHs)氨基酸序列片段WebLogo图；
[0026]图3为PCR产物凝胶电泳图；
[0027]图4大曲醇脱氢酶(L.ADHs)基因片段来源微生物属组成；
[0028]图5大曲醇脱氢酶(L.ADHs)基因片段来源微生物种组成。
【具体实施方式】
[0029]以下实施例用于非限制性地解释本专利技术的技术方案。
[0030]实施例1
[0031]采自来自3个不同地区的大曲样品，分别标记为河套地区(HT
‑
1、 HT
‑
2、HT
‑
3)、山东地区(SD
‑
1、SD
‑
2、SD
‑
3)和四川地区(SC
‑
1、SC
‑ꢀ
2、SC
‑
3)样品。
[0032]1、醇脱氢酶引物设计
[0033]从Uniport(https://www.uniprot.org/)数据库搜索L.ADHs的氨基 酸序列。再根据已报道的中高温大曲微生物多样性的研究结果，选取51 条L.ADHs氨基酸序列(包含细菌及真菌，附表1)。使用Bioedit(8.1.0) 中的ClusterW对获取的51条L.ADHs氨基酸序列进行多序列比对。根 据这些L.ADHs氨基酸序列，利用j
‑
CODEHOP (https://4virology.net/
virology
‑
ca
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增微生物醇脱氢酶基因片段的简并引物，所述简并引物核苷酸序列如下所示：L.ADHs
‑
F：5
′
ATAGAATACTGCGGCgtntgyca3
′
L.ADHs
‑
R：5
′
TTTGTACGCTGTTACnccngcrca3
′
。2.利用简并引物扩增微生物醇脱氢酶基因片段的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)提取待测样品微生物总DNA；(2)以步骤(1)中微生物总DNA为模板，用权利要求1所述简并引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物A1；(3)将扩增产物A1纯化，获得纯化扩增产物B1；(4)将纯化扩增产物B1进行高通量测序，通过获取测序结果是否含有醇脱氢酶和GroES
‑
like蛋白的操作分类单元判断待测样品微生物中是否含有醇脱氢酶。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于步骤(4)包括：高通量测序结果经FLASH拼接后，使用Usearch以95％～100...

【专利技术属性】
技术研发人员：满都拉，任宇婷，孙子羽，陈忠军，乔美灵，张保军，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：