克拉维酸免疫层析检测试纸条及检测方法技术

本发明专利技术公开了克拉维酸免疫层析检测试纸条及检测方法。所述克拉维酸免疫层析检测试纸条，包括依次粘贴在底板上的样品垫、NC膜、吸水垫和底板，其中NC膜上设有检测线和质控线，检测线包被有完全抗原BSA

【技术实现步骤摘要】
structure of wt SHV
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1 complex with a penam sulfone)中公开。
[0011]所述试纸条的检测线上包被的完全抗原BSA
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SA2
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13的终浓度为2mg/mL，质控线上包被的His融合标签抗体的终浓度为2mg/mL。
[0012]优选地，所述底板为PVC板。
[0013]优选地，所述样品垫的材料为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。
[0014]进一步地，所述试纸条是将样品垫、NC膜和吸水垫由底板的一面交互层叠黏贴到所述底板上；其中，NC膜位于最底层，样品垫和吸水垫以与NC膜2
‑
3mm的重叠接触贴于NC膜两端。
[0015]第二方面，本专利技术提供克拉维酸检测试剂盒，包括反应孔和所述克拉维酸免疫层析检测试纸条。
[0016]其中，所述反应孔包被有胶体金标记的β
‑
内酰胺酶蛋白复合物。
[0017]优选地，所述β
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内酰胺酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0018]反应孔包被的胶体金标记的β
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内酰胺酶蛋白复合物的终浓度为10μg/孔。
[0019]在本专利技术的一个具体实施方式中，反应孔的制备过程包括：
[0020]1、制备S.AUREUS PC1蛋白
[0021]1)S.AUREUS PC1基因的合成
[0022]从Genbank中获取S.AUREUS PC1基因编码的β
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内酰胺酶的氨基酸序列(Accession：TJX78208.1)，依据大肠杆菌的密码子偏好性进行S.AUREUS PC1基因碱基序列的密码子优化，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的基因序列。
[0023]2)载体的构建
[0024]通过将目的片段用His标签表达，克隆至表达载体pET
‑
28a，得到重组质粒pET
‑
28a
‑
S.AUREUS PC1。
[0025]3)S.AUREUS PC1重组蛋白的表达与纯化
[0026]构建完成的重组质粒转入感受态细胞转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD
600
达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，25℃条件下进行诱导表达。
[0027]4℃，3200g离心15min收集菌体；然后使用20mM Tris
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HCl(含150mM NaCl)重悬菌体，3000W，开启10s/停止10s，超声15min裂解菌体。采用Ni
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NTA镍柱纯化系统纯化表达的S.AUREUS PC1重组蛋白，得到S.AUREUS PC1蛋白，用于连接金纳米粒子，作为金标受体蛋白。
[0028]2、制备金标S.AUREUS PC1蛋白
[0029]1)合成并表征金纳米粒子
[0030]采用种子生成法合成平均粒径为35nm的GNPs。称取1.47mg柠檬酸三钠，溶解于20mL超纯水，加入0.5mL 0.4％(w/v)的氯金酸溶液和0.6mL 0.1M硼氢化钠溶液，室温放置30min，获得种子溶液。取2.5mL 0.4％(w/v)氯金酸溶液，用超纯水稀释至100mL，搅拌煮沸15min。随后，向溶液中加入0.75mL种子溶液和0.4mL新鲜配制的1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液。继续搅拌煮沸，直到溶液变为酒红色。保持沸腾5min后，停止加热，将溶液冷却至室温，得到GNPs溶液。通过TEM和UV
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Vis鉴定颗粒的粒径和分散性。
[0031]2)金纳米粒子标记受体蛋白(胶体金标记的β
‑
内酰胺酶蛋白复合物)
[0032]10mL GNPs溶液加入一定体积0.01mM K2CO3，以调节溶液pH。重组受体蛋白先用适宜的缓冲液稀释至0.4mg/mL，随后取一定量的受体蛋白加入到上述GNPs溶液中，室温振荡混匀45min。加入1mL金标封闭液(BSA终浓度为1％，w/v)，室温振荡封闭2h。封闭结束后，4℃，8000g离心30min，弃去上清，重复洗涤2次。沉淀重悬于1mL金标重悬液中，得到金标S.AUREUS PC1受体蛋白。将得到的金标受体蛋白分装至PVC塑料制成的透明微孔冻干(80μL/孔)，得到含有金标受体蛋白的红色微孔，即为反应孔。
[0033]第三方面，本专利技术提供所述克拉维酸免疫层析检测试纸条或所述克拉维酸检测试剂盒在克拉维酸检测中的应用。
[0034]第四方面，本专利技术提供克拉维酸免疫层析检测方法，包括以下步骤：
[0035](1)取200
±
20μL待测液体样本加至所述试剂盒的反应孔内，反复吹打，于40
±
2℃孵育4～6min；
[0036](2)将试纸条的样品垫一端插入到上述反应孔内，继续于40
±
2℃孵育4min；
[0037](3)孵育结束后，根据检测线和质控线的显色结果判定待测液体样本中是否含有克拉维酸。
[0038]进一步地，步骤(3)中结果判定标准如下：
[0039]阴性：质控线显色，检测线显色；
[0040]阳性：质控线显色，检测线不显色；
[0041]无效：质控线不显色，无论检测线是否显色，结果判为无效。
[0042]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0043]本专利技术利用与克拉维酸高亲和力结合的S.AUREUS PC1蛋白建立了一种检测液样(如奶样)中克拉维酸的侧流免疫层析法。利用β
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内酰胺酶蛋白与克拉维酸的结合的高亲和力，可快速、高灵敏度检测牛奶中的克拉维酸残留。该方法对克拉维酸的检测范围为4.7
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14μg/kg，IC
50
为8.08μg/kg，LOD为20μg/kg。
附图说明
[0044]图1为本专利技术较佳实施例中S.AUREUS PC1蛋白的SDS
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PAGE检测结果。
[0045]图2为本专利技术较佳实施例中抗原MALDI
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TOF检测质谱图。其中，A为未偶联前BSA的MALDI
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TOF检测图，B为偶联后的完全抗原的MALDI
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TOF检测图。
[0046]图3为本专利技术较佳实施例中牛奶中克拉维酸的检测标准曲线。
[0047]图4为本专利技术较佳实施例中试纸条对牛奶中不同浓度克拉维酸的检测结果。
[0048]图5为本专利技术较佳实施例中试纸条对牛奶中他唑巴坦、舒巴坦的检测结果。
具体实施方式
[0049]本专利技术提供一种基于克拉维酸敏感亚型β
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内酰胺酶检测克拉维酸的快速检测试纸条及其检测方法。包括本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.克拉维酸免疫层析检测试纸条，其特征在于，包括样品垫、NC膜、吸水垫和底板，所述NC膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、NC膜和吸水垫依次粘贴在底板上；其中，所述检测线包被有完全抗原BSA
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SA2
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13；所述质控线包被有His融合标签抗体；所述完全抗原BSA
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SA2
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13是由半抗原SA2
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13与载体蛋白BSA偶联而成；半抗原SA2
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13的结构如式(I)所示：2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条的检测线上包被的完全抗原BSA
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SA2
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13的终浓度为2mg/mL，质控线上包被的His融合标签抗体的终浓度为2mg/mL。3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述底板为PVC板；所述样品垫的材料为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜。4.根据权利要求1
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3任一项所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条是将样品垫、NC膜和吸水垫由底板的一面交互层叠黏贴到所述底板上；其中，NC膜位于最底层，样品垫和吸水垫以与NC膜2
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3mm的重叠接触贴于NC膜两端。5.克拉维酸检测试剂盒，其特征在于，包括反应孔和权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：温凯，沈建忠，王战辉，江海洋，于雪芝，余文博，贾良曦，马立才，鲁智敏，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：