本发明专利技术涉及生物防治技术领域，公开了一株对核桃长足象具有强致病力的菌株及其应用，该菌株为球孢白僵菌，于2021年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO：23261。本发明专利技术是首次从林间采集核桃长足象的僵虫上分离获得球孢白僵菌菌株，该菌株培养简单、生长迅速、产孢量大、孢子萌发率高，并且通过实验得知该菌株对核桃长足象成虫有较强的致病力，并且环境友好、不易产生抗药性，可以广泛地应用于核桃长足象的生物防治。足象的生物防治。足象的生物防治。
【技术实现步骤摘要】
一株对核桃长足象具有强致病力的菌株及其应用
[0001]本专利技术涉及生物防治
，尤其涉及一株对核桃长足象具有强致病力的菌株及其应用。
技术介绍
[0002]核桃是我国重要的经济树种之一,其木材、果实、枝叶、果壳,都有很高的利用和开发价值，核桃产业被许多地区确立为地域经济和新农村经济发展的主导产业之一，核桃产业能促进农民增收、拉动地区经济发展、同时改善生态环境,己在我国多个省份推广。但由于盲目引进新品种,使得品种良莠不齐,加之栽培面积不断扩大,果农放松管理,核桃病虫害发生严重,其中核桃长足象是核桃虫害的重要的虫害之一，进而导致单株产量低,品质下降。
[0003]核桃长足象(AlcidodesjuglansChao)又名核桃果象甲、核桃象甲虫等，隶属鞘翅目象甲科,是核桃果实的重要钻蛀性害虫，属于中度危险性林业有害生物, 在我国核桃产区均有分布。该虫以幼虫危害最严重，幼虫在核桃果内取食种仁，导致果实脱落，严重时果树绝收，这是影响核桃大量不正常落果减产的主要原因；成虫啃食嫩叶、嫩梢及幼果皮，影响果树生长，导致减产。
[0004]目前，对核桃长足象的防治方法主要采用人工检拾落果、树干注射、树冠喷药等方法。但是上述方法费时费力、产生食品安全问题、对环境污染重，因此探索一种高效、稳定、无污染的防治方法亟待解决。
技术实现思路
[0005]有鉴于此，本专利技术的目的之一是提供对核桃长足象具有强致病力的球孢白僵菌菌株，所述菌株为球孢白僵菌Beauveriabassiana，所述菌株于2021年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌种保藏编号为CGMCCNO： 23261，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006]所述菌株的ITS序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术的目的之二是提供所述菌株的具体分离纯化方法。
[0008]所述球孢白僵菌菌株是从核桃林采集的核桃长足象的僵虫上分离获得的，将核桃长足象浸于70％乙醇中消毒30s，然后用0.1％升汞消毒1.5min，再用灭菌水漂洗3次，用灭菌滤纸吸干核桃长足象成虫体上的水分，然后放置于PDA平板中。在27℃恒温培养箱中培养2
‑
3d，至虫体周围长出菌丝后，挑取菌丝转至新的PDA平板上，如此重复3次，然后用稀释纯化法对病菌进行单菌落分离。最终将分离纯化的菌株保存于PDA斜面培养基上，置于4℃冰箱保存。其培养初期菌落呈白色长绒状，背面无色，在光学显微镜下观察，菌丝透明；但至培养的后期，菌落呈淡黄色粉末状，菌落背面呈现淡黄色，而且菌丝和产孢细胞明显减少，仅见膨大的不规则的泡囊增生，显微镜下大量孢子在泡囊表面聚集成圆球状，分生孢子单孢，透明，多呈卵圆形，较大，直径1.05*2.14
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1.65*2.49μm。
[0009]本专利技术的目的之三是提供菌株在防治核桃长足象上的应用。具体应用为将所述球孢白僵菌菌株培养后制成孢子液、含孢子的菌剂，施用时菌株的孢子浓度为 1
×
106孢子/mL
‑1×
108孢子/mL，以达到对核桃长足象的绿色防治。
[0010]本专利技术的有益效果：本专利技术是首次从感病的核桃长足象中分离获得球孢白僵菌菌株，该菌株培养简单、生长迅速、产孢量大、孢子萌发率高，并且通过实验得知该菌株对核桃长足象成虫、若虫均有较强的致病力，并且环境友好、不易产生抗药性，可以广泛地应用于核桃长足象的生物防治。
附图说明
[0011][0012]图1是球孢白僵菌菌株(保藏编号为CGMCCNO：23261)在PDA平板上培养形成的菌落其中，A为菌落正面、B为菌落背面，C、D为菌丝形态特征；
[0013]图2是球孢白僵菌菌株(保藏编号为CGMCCNO：23261)分生孢子及分生孢子梗电镜扫描照片；
[0014]图3是球孢白僵菌菌株(保藏编号为CGMCCNO：23261)分生孢子光学显微镜照片；
[0015]图4是本专利技术分子鉴定中PCR扩增产物电泳图(框线内为本申请样本)。
具体实施方式
[0016]以下将结合实施例对本专利技术进行详细说明，但并不作为对本专利技术限制的依据。
[0017]PDA培养基配方：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15
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20g、蒸馏水1000ml，自然pH。
[0018]被核桃长足象僵虫采集于贵州省清镇市犁倭镇右八村。
[0019]实施例1：球孢白僵菌的分离与鉴定
[0020](1)分离纯化与保存
[0021]将核桃长足象浸于70％乙醇中消毒30s，然后用0.1％升汞消毒1.5min，再用灭菌水漂洗3次，用灭菌滤纸吸干核桃长足象成虫体上的水分，然后放置于PDA 平板中。在27℃恒温培养箱中培养2
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3d，至虫体周围长出菌丝后，挑取菌丝转至新的PDA平板上，如此重复3次，然后用稀释纯化法对病菌进行单菌落分离，得到复壮的、致病力强的球孢白僵菌菌株。所获得的高毒力菌株转接到新鲜PDA斜面培养基上，然后在4℃条件下进行保存。于2021年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCCNO：23261，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0022](2)菌株的鉴定
[0023]根据所分离菌株纯培养的菌落特征、菌丝和分生孢子的形态特征进行鉴定。实验结果表明：从被虫生真菌自然侵染的核桃长足象成虫虫体上分离所获得的菌株，在PDA培养基上获得纯培养，按照科赫法则，对该菌种进行复壮和分离纯化，分离纯得菌株的纯培养，即球孢白僵菌菌株。其菌落特征为：其培养初期菌落呈白色长绒状，背面无色，在光学显微镜下观察，菌丝透明；但至培养的后期，菌落呈淡黄色粉末状，菌落背面呈现淡黄色，而且菌丝和产孢细胞明显减少，仅见膨大的不规则的泡囊增生，显微镜下大量孢子在泡囊表面聚集成圆球状，分生孢子单孢，透明，多呈卵圆形，较大，直径1.05*2.14
‑
1.65*2.49μm，见附图
1
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3。根据核桃长足象的感染症状，菌落和菌体特征，分析该菌株为球孢白僵菌。
[0024]实施例2菌株的分子鉴定
[0025](1)真菌基因组DNA提取
[0026]用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型)提取球孢白僵菌菌株的基因组DNA，具体步骤为：
[0027]S1：将SpinCoulumn置于CollectionTube中，加入250μLBufferBL，12000rpm/min离心1min活化硅胶膜；
[0028]S2：将样本干燥组织(≤20mg)加入液氮充分研磨，研磨后置于1.5ml离心管中，加入400μLBuffergP1，涡旋振荡1min，65℃水浴10
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30min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；
[0029]S3：加入150μLBuffergP2，涡旋振荡1min本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一株对核桃长足象具有强致病力的菌株，其特征在于，所述菌株为球孢白僵菌，于2021年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO：23261。2.根据权利要求1所述的一株对核桃长足象具有强致病力的菌株，其特征在于，所述菌株ITS序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的一株对核桃长足象具有强致病力的菌株，其特征在于，所述菌株的菌落形态为：其培养初期菌落呈白色长绒状，背面无色，在光学显微镜下观察，菌丝透明；但至培养的后期，菌落呈淡黄色粉末状，菌落背面呈现淡黄色，而且菌丝和产孢细胞明显减少，仅见膨大的不规则的泡囊增生，显微镜下大量孢子在泡囊表面聚集成圆球状，分生孢子单孢，透明，多呈卵圆形...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵玉雪，朱佳敏，杨霞，吴柳燕，苏州，
申请(专利权)人：贵州省核桃研究所，
类型：发明
国别省市：
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