本发明专利技术提供了一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其通过转基因技术获得两种丝胶茧系统，选取丝胶茧中丝胶含量较多的一种的丝胶茧为生物反应器，通过以Ser1为启动子，增强型绿色荧光蛋白EGFP为目的基因，构建转基因表达载体并且获得转基因家蚕。本发明专利技术根据利用piggyBac介导的家蚕遗传改良技术，利用转基因丝胶茧作为注射受体，在家蚕中部丝腺表达外源蛋白，使外源蛋白的提取和纯化更加容易，为探索开发利用丝胶茧受体表达重组蛋白提供素材基础。基础。基础。
【技术实现步骤摘要】
一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法
[0001]本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法。
技术介绍
[0002]近些年来，随着生物技术的蓬勃发展，特别是近年在家蚕基因组计划的推动下，人们对丝腺高效合成与分泌丝蛋白的分子机制有了深入了解，研究者们开始对蚕丝进行结构与功能化的改造，开发蚕丝的新用途。
[0003]2000年开始，研究人员利用piggyBac转座子介导，成功建立了家蚕转基因技术，该技术可以对家蚕以及蚕丝进行遗传改造，赋予蚕丝特定的生物学性能，使得蚕丝能够应用于更多领域。同时还发现，家蚕不仅能用于产丝织绸，其丝腺还是一个理想的生物反应器，可用于生产高附加值重组外源蛋白。
[0004]家蚕丝腺是一个天然蛋白生产工厂，能够高效的合成丝蛋白。迄今，利用转基因家蚕丝腺作为生物反应器，已经表达出了20多个重组蛋白，并且在转基因家蚕丝腺中表达的重组蛋白大都具有生物学活性，表明家蚕丝腺是生产重组蛋白的理想宿主。但是，当前的转基因丝腺表达系统存在重组蛋白表达量普遍较低的问题，难以在各个指定工业领域中得到工业化量产应用。
技术实现思路
[0005]基于现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，所述转基因丝胶茧生物反应器的构建方法具体涉及到两种转基因丝胶茧。
[0006]依据本专利技术的技术方案，提供一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其通过转基因技术获得两种丝胶茧系统，选取丝胶茧中丝胶含量较多的一种的丝胶茧为生物反应器，通过以家蚕Ser1基因(SEQ ID NO.1)为启动子，增强型绿色荧光蛋白EGFP为目的基因(SEQ ID NO.2)，构建转基因表达载体并且获得转基因家蚕。
[0007]进一步地，转基因丝胶茧生物反应器的构建方法包括以下步骤：
[0008]步骤S1，构建丝胶茧表达载体；
[0009]步骤S2，胚胎显微注射与荧光筛选；
[0010]步骤S3，中部丝腺特异表达载体构建；
[0011]步骤S4，再一次进行胚胎显微注射与荧光筛选；
[0012]步骤S5，通过对中部丝腺进行荧光观察和分子检测，验证重组蛋白表达成功；
[0013]步骤S6，通过对茧壳形态和茧壳蛋白的分子检测，验证重组蛋白已经成功分泌。
[0014]优选地，步骤S1进一步包括步骤S11,
[0015]构建了以家蚕fibL基因[NCBI基因ID：M76430.1](SEQ ID NO.3)为启动子，BmY1314突变其第97位氨基酸位点(BmY1314S97A)(SEQ ID NO.4)为目的基因，终止信号为Ser1
‑
polyA(SEQ ID NO.5)，串联形成目的基因表达框，通过利用AscI将骨架载体pBac[3
×
P3
‑
DsRed]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接。
[0016]更优选地，步骤S1进一步包括步骤步骤S12，构建了以家蚕fibH基因[NCBI基因ID：NM_001113262.1](SEQ ID NO.6)为启动子，BmY1314突变其第97位氨基酸位点(BmY1314S97A)(SEQ ID NO.4)为目的基因，Ser1
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polyA(SEQ ID NO.5)为终止信号，串联形成目的基因表达框，通过利用AscI将骨架载体pBac[3
×
P3
‑
ECFP]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接。
[0017]优选地，转基因丝胶茧生物反应器的构建方法进一步包括获得转基因表达载体后，将其与辅助质粒1:1分别以浓度450ng/μL(纳克/微升)等比例混合，通过埃普多夫(Eppendorf)显微注射仪注射，以多化性家蚕Nistari为注射受体，进行转基因注射及荧光筛选。
[0018]优选地，步骤S3中部丝腺特异表达载体构建中，家蚕Ser1基因启动子序列[NCBI基因ID：AB007831.1](SEQ ID NO.1)，将上述丝腺特异性启动子与增强子Hr3序列(SEQ ID NO.7)，增强型绿色荧光蛋白EGFP基因序列(SEQ ID NO.2)及终止信号Ser1
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poly A(SEQ ID NO.5)串联形成目的基因表达框，将通过利用FseI和SpeI将骨架载体pBac[3
×
P3
‑
ECFP]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接。所构建的表达载体的构建均含有启动子3
×
P3启动的青色荧光蛋白(ECFP)基因表达框。
[0019]此外，转基因家蚕的丝腺收集包括，饲养注射受体LYS97A和S1
‑
EGFP(LYS97A)转基因家蚕至5龄第6天(5L6D)，通过在1
×
PBS的缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水)中解剖家蚕丝腺，并将丝腺分为前部丝腺(ASG)、中部丝腺(MSG)、后部丝腺(PSG)，通过1.5mL(毫升)的离心管收集中部丝腺。
[0020]进一步地，将收集的中部丝腺进行基因组提取，提取步骤包括将研钵及研磨棒进行清洗后，置于烘箱中180℃(度)高温灭菌2
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3h(小时)。在研磨操作进行前需对丝腺、研钵及研磨棒进行液氮预冷处理。预冷后对丝腺进行研磨至粉末后转移至1.5mL的离心管中，保存于液氮或
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80℃备用。
[0021]优选地，将收集的中部丝腺进行基因组提取，提取步骤包括将1mL的DNA抽提Buffer(缓冲液)加入离心管中，离心机以3000rpm(每分钟转数)涡旋混匀；按100μL/mL(微升/毫升)的工作浓度加入RNA酶，置于37℃恒温水浴锅中消化1小时后加入蛋白酶K，55℃水浴消化过夜。
[0022]优选地，将收集的中部丝腺进行基因组提取，提取步骤包括将等体积的Tris饱和酚添加至离心管中后充分旋转振荡10min(分钟)，在温度4℃环境下离心机以13400rpm离心10min，取600μL上清液至新的离心管中。
[0023]相比较于现有技术，本专利技术专利的一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法具有以下有益效果：
[0024]1、本专利技术转基因丝胶茧生物反应器的构建方法根据利用piggyBac介导的家蚕遗传改良技术，利用转基因丝胶茧作为注射受体，在家蚕中部丝腺表达外源蛋白，并探究外源蛋白在丝胶茧中是否利于提取和分离纯化，为探索开发利用丝胶茧受体表达重组蛋白提供素材基础。
[0025]2、利用本专利技术转基因丝胶茧生物反应器的构建方法所获得家蚕丝胶蛋白具有良好的亲水性、生物相容性和可生物降解性，其是一种理想的组织工程生物材料。
[0026]3、本专利技术利用遗传操作技术赋予了蚕丝新的生物学性质后，使其在作为良好的药物缓释材料的基础上，进一步获得了需借助第三方渠道而获得的各类具有药用价值的蛋白；其对将含有高附加值外源蛋白的蚕丝转化为功能性生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其特征在于，其通过转基因技术获得两种丝胶茧系统，选取丝胶茧中丝胶含量较多的一种丝胶茧为生物反应器，通过以家蚕Ser1基因(SEQ ID NO.1)为启动子，增强型绿色荧光蛋白EGFP(SEQ ID NO.2)为目的基因，构建转基因表达载体并且获得转基因家蚕。2.依据权利要求1所述的转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤S1，构建丝胶茧表达载体；步骤S2，胚胎显微注射与荧光筛选；步骤S3，中部丝腺特异表达载体构建；步骤S4，再一次进行胚胎显微注射与荧光筛选；步骤S5，通过对中部丝腺进行荧光观察和分子检测，验证重组蛋白表达成功；步骤S6，通过对茧壳形态和茧壳蛋白的分子检测，验证重组蛋白已经成功分泌。3.依据权利要求2所述的转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其特征在于，步骤S1进一步包括步骤S11,构建了以家蚕fibL基因[NCBI基因ID：M76430.1](SEQ ID NO.3)为启动子，BmY1314突变其第97位氨基酸位点(BmY1314S97A)(SEQ ID NO.4)为目的基因，终止信号为Ser1
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polyA(SEQ ID NO.5)，串联形成目的基因表达框，通过利用AscI将骨架载体pBac[3
×
P3
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DsRed]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接。4.依据权利要求2所述的转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其特征在于，步骤S1进一步包括步骤步骤S12，构建了以家蚕fibH基因[NCBI基因ID：NM_001113262.1](SEQ ID NO.6)为启动子，BmY1314突变其第97位氨基酸位点(BmY1314S97A)(SEQ ID NO.4)为目的基因，Ser1
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polyA(SEQ ID NO.5)为终止信号，串联形成目的基因表达框，通过利用AscI将骨架载体pBac[3
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P3
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ECFP]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接。5.依据权利要求3所述的转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其特征在于，进一步包括获得转基因表达载体后，将其与辅助质粒分别以浓度450ng/μL等比例混合，通过Eppendorf显微注射仪注射，以多化性家蚕Nistari为注射受体，进行转基...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐汉福，刘荣鹏，王浩淼，马艳，唐艺芸，胡杰，欧瑶，马静文，向仲怀，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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