红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因HcTrx及其重组载体在VIGS沉默体系中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，涉及红麻VIGS沉默体系，特别是指红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因HcTrx及其重组载体在VIGS沉默体系中的应用。其碱基序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术首次对红麻叶绿体中的硫氧还蛋白类似蛋白（Thioredoxin

【技术实现步骤摘要】
红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因HcTrx及其重组载体在VIGS沉默体系中的应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，涉及红麻VIGS沉默体系，特别是指红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因HcTrx及其重组载体在VIGS沉默体系中的应用。

技术介绍

[0002]红麻（Hibiscus cannabinus L.）是一种重要的纤维作物，已有4000多年的栽培历史，现已在20多个国家进行商业化种植，其总产量的95%以上主要来自中国、印度和泰国。红麻纤维具有柔软、韧度大、吸湿性好以及可降解等优势，其多功能用途包括制作纸张、建筑材料、麻纺产业、环境友好吸附材料、生物复合材料等产品，市场前景广阔，被视为21世纪极具发展潜力的作物和未来派作物。因此，为保障红麻产业的可持续发展亟需加强红麻种质资源创新研究，培育优质高产的红麻新品种。
[0003]利用基因工程手段是获得红麻新种质的有效途经，但目前由于缺乏有效的红麻遗传转化和再生体系方法，极大的限制了对红麻内源性功能基因的深入研究和应用。病毒诱导的基因沉默（Virus
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induced gene silencing，VIGS）技术是研究植物基因功能的一种快速而有效的方法，不需要遗传转化，具有周期短、成本低、操作简单和沉默效率高等优势，广泛的应用于植物生长发育、抗病抗逆、代谢调控等相关基因的功能鉴定。目前VIGS技术已经在烟草、拟南芥、小麦、水稻、玉米、番茄等多种植物研究中取得了成功。
[0004]专利202010073462.1公开了一种红麻HcPDS基因VIGS沉默体系，该体系通过构建含有HcPDS基因特异性片段的pTRV2病毒沉默表达载体，该载体经农杆菌介导转化红麻，诱导红麻内源HcPDS基因发生沉默，有效降低了红麻HcPDS基因的表达水平，导致白化表型。该体系的转化模式为通过侵泡法将红麻种子在混合菌液中浸泡24 h，然后进行种植，所得的植株出现白化表型；这种模式的周期较长，延长了试验周期，为了进一步摸索获得较短时间就能出现表型差异的方法以及进一步发现新的报告基因，本课题进行了深入的摸索。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提出一种红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因HcTrx及其重组载体在VIGS沉默体系中的应用。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因HcTrx，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]上述的基因HcTrx表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]上述的基因HcTrx作为红麻报告基因中的应用。
[0009]优选的，所述应用是通过构建基因HcTrx的重组载体侵染红麻植株实现的。
[0010]优选的，所述重组载体为病毒载体。
[0011]优选的，所述病毒载体为烟草脆裂病毒。
[0012]上述的应用，实验步骤为：
（1）克隆红麻HcTrx基因的全长，构建重组质粒Blunt
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HcTrx；（2）以步骤（1）的重组质粒Blunt
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HcTrx为模板，以特异性片段的引物对为引物进行扩增，回收目的片段，将目的片段连接到pTRV2载体上，构建pTRV2
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HcTrx重组质粒；（3）将含pTRV2
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HcTrx重组质粒的菌液与pTRV1辅助载体的菌液等比例混合后注射至红麻叶片，暗培养后正常培养得花斑型植株。
[0013]所述步骤（2）中特异性片段的序列如SEQ ID No.3所示。
[0014]所述步骤（3）中注射至红麻叶片的浸润面积＞75%整个叶片的面积。
[0015]进一步，所述步骤（3）中暗培养的时间为35
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37小时。
[0016]本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术从红麻中克隆获得了一个硫氧还蛋白类似蛋白（Thioredoxin
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like protein，Trx）基因，该基因定位于叶绿体中，位于叶绿体中的Trx蛋白所对应的编码基因发生突变或沉默后，突变体有明显的花斑表型，是易于识别的标记性状，可以作为VIGS体系应用的报告基因。
[0017]2、本申请构建了携带HcTrx序列的烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus, TRV）重组载体，通过叶片注射法侵染红麻后，诱导HcTrx基因发生沉默，沉默后植株中HcTrx基因的表达量显著下降，出现典型的花斑表型。本专利技术构建的携带HcTrx序列的TRV重组载体可以作为红麻VIGS技术体系中的阳性对照，并探索和优化了红麻的VIGS技术体系，为VIGS技术在红麻中的应用奠定了坚实的理论和实践基础，也为硫氧还蛋白类似蛋白Trx
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like，以及VIGS技术体系在其他作物中的应用提供了借鉴。
[0018]3、本专利技术首次对红麻叶绿体中的硫氧还蛋白类似蛋白（Thioredoxin
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like protein, Trx）基因进行了克隆和亚细胞定位分析；构建了红麻HcTrx基因沉默体系，该体系具有快速、高通量、效果好以及易于操作的特点；本专利技术所述的HcTrx基因及沉默体系有效的降低了红麻HcTrx基因的表达水平，叶绿素合成受到影响，导致花斑表型，能够作为VIGS沉默体系在红麻应用中的报告基因。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为红麻HcTrx基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。M，DL2000 DNA Marker；泳道1、2，HcTrx基因。
[0021]图2为红麻HcTrx的亚细胞定位。
[0022]图3为构建重组病毒载体pTRV2
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HcTrx、空载体pTRV2和辅助载体pTRV1农杆菌菌落PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图。M，DL2000 DNA Marker；泳道1
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3，重组病毒载体pTRV2
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HcTrx农杆菌单克隆；泳道4
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6，空载体pTRV2农杆菌单克隆；泳道7
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9，辅助载体pTRV1农杆菌单克隆。
[0023]图4为叶背注射法进行VIGS浸染过程及红麻新叶花斑表型形态示意图。
[0024]图5为实时荧光定量（qRT
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PCR）检测红麻HcTrx基因的沉默效果。TRV:00，空载体
pTRV2对照植株；TRV:HcTrx
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1~10，重组病毒载体pTRV2
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HcTrx沉默植株。
具体实施方式
[0025]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.红麻硫氧还蛋白类似蛋白基因HcTrx，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。2.权利要求1所述的基因HcTrx表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。3.权利要求1所述的基因HcTrx作为红麻报告基因中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用是通过构建基因HcTrx的重组载体侵染红麻植株实现的。5.根据权利要求4的应用，其特征在于：所述重组载体为病毒载体。6.根据权利要求5的应用，其特征在于：所述病毒载体为烟草脆裂病毒。7.根据权利要求3
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6任一项所述的应用，其特征在于，步骤为：（1）克隆红麻Trx基因的全长，构建重组质粒Blunt
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HcTrx；（2）以步骤（1）的重组质粒Blunt

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鹏，唐美琼，李增强，岳娇，曹珊，罗登杰，王财金，
申请(专利权)人：广西壮族自治区药用植物园，
类型：发明
国别省市：