用于鉴别九华黄精的叶绿体基因组及其在九华黄精鉴别中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种九华黄精叶绿体基因组及其在九华黄精鉴别中的应用，九华黄精叶绿体基因组包括九华黄精叶绿体基因组中的4个具有特定功能并具有高度特异性的基因，分别为rpoB、ycf4、ndhF、trnI

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别九华黄精的叶绿体基因组及其在九华黄精鉴别中的应用


[0001]本专利技术涉及黄精鉴别
，具体是一种用于鉴别九华黄精的叶绿体基因组及其在九华黄精鉴别中的应用。

技术介绍

[0002]多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)曾隶属于广义百合科(Liliaceae)，黄精属(Polygonatum)。在最新的APG IV系统中，通过分子系统发育研究，将其归于天门冬科(Asparagaceae)中。多花黄精种内的亲缘关系及物种界定至今仍存在争议，并且历史上对黄精属的系统分类问题也比较混乱。由于种内变异大，各地多花黄精质量参差不齐，严重影响产业化进程。
[0003]多花黄精中具有地方特色的九华黄精因质量上乘，入选中国国家地理标志产品，入列“十大皖药”。随着生物技术的发展，现代研究发现黄精属植物的根状茎含有多糖、甾体皂碱、蒽醌类、各种生物碱、木脂素等多种成分，因此，九华黄精的药用价值也越来越得到人们的关注。为此，需要为九华黄精的物种界定提供更多证据。
[0004]叶绿体是绿色植物中的核心细胞器，在光合作用以及碳固定功能中起着至关重要的作用。高等植物中的叶绿体基因组由一个LSC区、一个SSC区和两个IRA区构成环状双链，大小在120
‑
180kb(千碱基对)之间，可进行独立的复制和转录。对于某一物种，叶绿体基因组结构保守，遗传性变异小，但对比不同物种间的叶绿体基因组信息，又存在序列重排、收缩、扩张等现场。
[0005]九华黄精的叶绿体全基因组序列长度约158Kb，基于现有技术对其进行大样本测序、组装，成本较高且存在一定的难度，不利于商业化推广。目前，现有基于叶绿体基因atpB
‑
rbcL，matK，rbcL and rps16无法对九华黄精以及与其亲缘关系较近的黄精属进行有效鉴定。为此，开发一种长度适中且能够有效鉴别九华黄精的DNA条形码非常必要。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在提供一种九华黄精叶绿体基因组及其在九华黄精鉴别中的应用，实现九华黄精快速且准确的鉴别。
[0007]本专利技术保护一种用于鉴别九华黄精的叶绿体基因组及其在鉴别九华黄精中的应用，包括九华黄精叶绿体基因组中的4个具有特定功能并具有高度特异性的基因，分别为rpoB、ycf4、ndhF、trnI
‑
GAU，其核苷酸序列依次为SEQ ID NO.1～4所示。
[0008]本专利技术还保护一种九华黄精鉴别方法，包括以下步骤：
[0009]步骤1，采集新鲜待测九华黄精样本叶片，提取样品总DNA；
[0010]步骤2，以SEQ ID NO.1～4高变区的基因组序列，采用SEQ ID NO.5～12对应的引物进行PCR扩增，并进行电泳检测，若扩增长度与设计目的片段一致且仅有一条带，则PCR扩增成功；
[0011]步骤3，将PCR产物基于MGISEQ2000平台进行双向测序；
[0012]步骤4，将得到的SEQ ID NO.1～4高变区基因序列，按rpoB、ycf4、ndhF、trnI
‑
GAU顺序拼接，并与权利要求1所述的叶绿体基因组进行对齐、校对；
[0013]步骤5，利用校对后的序列构建NJ/ML/Bayes树，若与权利要求1所述的叶绿体基因组序列聚为一支且支持率大于80，则确定其为九华黄精。
[0014]本专利技术在对黄精属叶绿体全基因组分析基础上，通过组合叶绿体基因组4个高变区序列基因，实现九华黄精快速且准确的鉴别，对于与九华黄精亲缘关系较近的黄精属各物种，也可以使用本专利技术提供的叶绿体基因组进行快速且准确的鉴别。
附图说明
[0015]图1是基于本专利技术提供的4段高变区序列组合的38个黄精属NJ树聚类图；
[0016]图2是基于本专利技术提供的4段高变区序列组合的38个黄精属ML树聚类图；
[0017]图3是基于本专利技术提供的4段高变区序列组合的38个黄精属Mrbays树聚类图；
[0018]图4是基于38个黄精属个体叶绿体全序列的NJ树聚类图。
具体实施方式
[0019]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。本专利技术的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本专利技术限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本专利技术的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本专利技术从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
[0020]实施例1
[0021]一、样本收集
[0022]采集不同区域九华黄精的嫩叶，于装有硅胶分子的样本袋内快速干燥保存备用，并采集其他区域黄精用于对比，所用黄精样本如表1所示。
[0023]物种拉丁名样本来源九华黄精1Polygonatumcyrtonema安徽
·
池州九华黄精2Polygonatumcyrtonema安徽
·
池州九华黄精3Polygonatumcyrtonema安徽
·
池州九华黄精4Polygonatumcyrtonema安徽
·
黄山湖北黄精Polygonatumzanlanscianense安徽
·
宣城金寨黄精Polygonatumjinzhaiense安徽
·
六安长梗黄精Polygonatumfilipes安徽
·
池州大皿黄精Polygonatumdaminense浙江
·
金华玉竹Polygonatumodoratum安徽
·
安庆
[0024]表1
[0025]二、基因组DNA提取
[0026]本实施例采用CTAB法提取样本总DNA，具体实验步骤如下：
[0027]1、取表1中各种黄精的叶片，置于2mL离心管，加入2颗灭菌钢珠，液氮冷冻，球磨仪
研碎；
[0028]2、加入800μL CTAB提取缓冲液，65℃水浴1h，期间每隔15min颠倒混匀若干次；
[0029]3、加入800μL苯酚：氯仿：异丙醇(质量比25：24：1)，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，将上层水相转移至另一2mL离心管；
[0030]4、加入400μL氯仿：异丙醇(质量比24:1)，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，将上清液转移至另一1.5mL离心管；
[0031]5、加入0.6倍体积的异丙醇，
‑
20℃沉淀30min以上，12000rpm离心10min，弃去上清液，加入75％乙醇洗涤两次，真空干燥仪干燥40min左右；
[0032]6、加水溶解DNA，用超声波破碎仪随机打断总DNA序列，修复打断的序列末端并加A尾以及测序接头；
[0033]7、切胶回收、纯化。
[0034]三、PCR扩增
[0035]对4个高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于鉴别九华黄精的叶绿体基因组，其特征在于，包括九华黄精叶绿体基因组中的4个具有特定功能并具有高度特异性的基因，分别为rpoB、ycf4、ndhF、trnI
‑
GAU，其核苷酸序列依次为SEQ ID NO.1～4所示。2.权利要求1所述的用于鉴别九华黄精的叶绿体基因组在鉴别九华黄精中的应用。3.一种九华黄精鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，采集新鲜待测九华黄精样本叶片，提取样品总DNA；步骤2，以SEQ ID NO.1～4高变区的基因组序列，采用SEQ ID NO.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙松，龙子江，吴存林，乔学芹，
申请(专利权)人：合肥仟金草生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：