生产β-烟酰胺单核苷酸的重组微生物及构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种生产β

【技术实现步骤摘要】
生产
β
‑
烟酰胺单核苷酸的重组微生物及构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种生产β
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烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]烟酰胺单核苷酸(NMN，CAS:1094
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7)是一种自然存在的生物活性核苷酸，是人体内固有的物质，也富含在一些水果和蔬菜中。NMN有α和β2种不规则存在形式，而β
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异构体是NMN的活性形式，其分子式为C
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H
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N2O8P，分子量为334.22。在哺乳动物体内，β
‑
烟酰胺单核苷酸由烟酰胺(Nicotinamide，Nam)在Nampt(烟酰胺磷酸核糖转移酶)的催化下生成，随后烟酰胺单核苷酸在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的催化下生成NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。烟酰胺单核苷酸是补充NAD+的关键前提物质之一。哺乳动物体内的NAD+经由细胞内的酶生成NMN和Nam，在NAD+供应不足时，细胞会重新利用NMN和Nam来合成NAD+。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。此外，研究发现NMN对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；且NMN还可参与或调节机体的内分泌，具有保护和修复胰岛的功能，从而增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病。因此，NMN在医药治疗以及功能食品方面有着广泛的应用前景。
[0003]NMN的体外制备方法包括化学合成，半酶法合成和全酶法合成，其中以化学合成为主。化学合成方法存在成本高、收率低而且化学试剂污染大等问题。例如，2002年，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在TMSOTf的催化下发生缩合反应；2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应。半酶法合成是利用化学合成制备烟酰胺核糖，再利用烟酰胺核糖激酶和外源的ATP合成NMN。全酶法则是利用烟酰胺磷酸核糖转移酶以烟酰胺，磷酸核糖焦磷酸和ATP直接合成NMN。采用Nampt催化Nam生成NMN，不仅需要酶法合成磷酸核糖焦磷酸，整个合成中需要大量昂贵的ATP，而且由于现有的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的酶活性较低，使得酶法反应存在耗时长、成本高、收率低等问题，难以实现工厂化大规模生产，因此限制了NMN的大规模应用。
[0004]生物发酵法生产NMN，主要是利用微生物菌株自身的生物合成途径来生产NMN，克服酶法生产中的限制因素，其优势在于以糖质为原料生产核苷酸类物质，符合食用习惯，生产成本低、效益高，特别是目前基因工程育种技术及高产优化控制技术的采用，使发酵法生产成本大大降低。例如，专利CN202110815270.8公开了一种利用发酵培养法制备NMN的方法，所述方法为通过培养酿酒酵母KH09制备烟酰胺单核苷酸。专利CN202010498732.3公开了一种生产β
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烟酰胺单核苷酸的重组微生物，并利用该重组微生物生产β
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烟酰胺单核苷酸，重组微生物菌种含有一个或几个下列特征或全部特征，这些特征为：(1)在发酵培养基中添加烟酰胺经由重组微生物转化生成NMN；(2)过表达烟酰胺磷酸核糖转移酶；(3)重组微生物基因组上编码5
’‑
脱氧核苷酸酶的基因缺失或者失活或者酶活降低。
[0005]尽管如此，由于发酵法是通过微生物自身合成途径获得高浓度的NMN，通过对发酵
过程中的大量数据分析，发现当微生物细胞体内积累一定量的NMN后，对其自身的生长会受到不同程度的影响，造成菌代谢受限，产量无法近一步提高。因此，亟需找到一种能够解除细胞生长限制且易于操作，可应用于工业化生产NMN的方法。

技术实现思路

[0006]针对以上问题，本专利技术提供了一种生产β
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烟酰胺单核苷酸的重组微生物及其构建方法和应用。本专利技术通过表达转运蛋白从而获得高产β
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烟酰胺单核苷酸的重组微生物，该重组微生物可用于NMN的高效工业化生产，达到绿色环保低成本的NMN生产。
[0007]术语：
[0008]1、NMN：如无特殊说明，本专利技术中的英文简称“NMN”指β
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烟酰胺单核苷酸，其分子式为C
11
H
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N2O8P，分子量334.22，结构式如下式(1)所示。
[0009][0010]2、重组微生物：如无特殊说明，本专利技术中的中文名称“重组微生物”指经过人为处理后的微生物；所述的人为处理包括但不限于：基因敲除、基因抑制、基因沉默、基因插入、基因突变、外源表达或过表达基因等本领域所有可以实现基因操作的技术手段。
[0011]3、宿主菌：如无特殊说明，本专利技术中的中文名称“宿主菌”指待进行人为处理的微生物。
[0012]4、种子液：如无特殊说明，本专利技术中的中文名称“种子液”指经微生物经试管斜面活化、扁平或摇瓶培养或种子罐逐级扩大培养后，获得的含有一定微生物数量，活力、质量较优的微生物培养液。
[0013]5、高产：如无特殊说明，本专利技术中的“高产”指β
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烟酰胺核糖产量高于亲本微生物。
[0014]6、低产：如无特殊说明，本专利技术中的“低产”指β
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烟酰胺核糖产量低于亲本微生物。
[0015]7、外源表达或过表达：在相对于本专利技术使用时应被广义地认为包括在相同条件下与亲本微生物的一种或多种蛋白质(包括编码一种或多种蛋白质的一种或多种核酸)表达水平相比所述蛋白质表达(包括核酸表达)的任何增加。不应被认为意指所述蛋白质(或核酸)以任何具体水平表达。
[0016]8、亲本微生物：是本专利技术的微生物所来源于的微生物。本专利技术的微生物可以通过任何方法例如人工或天然选择、突变或基因重组而产生。亲本微生物可以是天然存在的微生物(即野生型微生物)或先前曾被修饰过但是不生产或不过度生产β
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烟酰胺单核苷酸的微生物。
[0017]9、载体：应被广义地认为包括适合用作媒介将遗传物质转移到细胞中的任何核酸(包括DNA和RNA)，包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。载体可以包括一种或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或可选择标记物。
[0018]10、关于蛋白和基因名称的约定：本专利技术中涉及的英文蛋白名称均为大写正体；本专利技术中涉及的英文基因名称均为小写斜体。
[0019]为了实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0020]一方面，本专利技术提供了一种转运蛋白或其编码基因在调节β
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烟酰胺单核苷酸产量中的应用，所述的转运蛋白为YihN、MdtH、MdtL、SetC或EmrD中的一种或多种。
[0021]具体地，所述的转运蛋白为YihN或Emr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.转运蛋白或其编码基因在调节β
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烟酰胺单核苷酸产量中的应用，其特征在于：所述的转运蛋白为YihN、MdtH、MdtL、SetC或EmrD中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的转运蛋白为YihN或EmrD中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述转运蛋白的含量或活性降低，和/或，编码所述转运蛋白的基因缺失、失活或活力降低，以降低调节β
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烟酰胺单核苷酸的产量；或：所述转运蛋白的含量或活性提高，和/或，编码所述转运蛋白的基因增加、拷贝数或活力提高，以提高调节β
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烟酰胺单核苷酸的产量。4.转运蛋白或其编码基因在制备高产或低产β
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烟酰胺单核苷酸的微生物中的应用，其特征在于：所述的转运蛋白为YihN、MdtH、MdtL、SetC或EmrD中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的转运蛋白为YihN或EmrD中的一种或多种。6.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：万丽花，田锋，江君君，刘鹏，黄祝渊，
申请(专利权)人：苏州华赛生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：