一种用于制备环状RNA的载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于制备环状RNA的载体及其应用。本发明专利技术首先提供一种用于制备环状RNA的载体，其包含能够转录为环状RNA前体分子的DNA序列，所述环状RNA前体分子的3

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备环状RNA的载体及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及提供一种用于制备环状RNA的载体及其应用。

技术介绍

[0002]环状RNA(circular RNA,circRNA)与传统的线性RNA(linear RNA)不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，不易降解，表达更稳定。Wesselhoeft,R.A.等曾报道基于I型自剪切内含子设计的高效RNA环化工具，其使用的环化载体包含了柯萨奇病毒的IRES元件(CVB3 IRES)、Gaussia荧光素酶(GLuc)和Anabaena pre
‑
tRNA的I型内含子，将Anabaena pre
‑
tRNA的I型内含子拆分后设计在待环化序列的两侧。在GTP和镁离子存在的条件下，环状RNA前体分子能通过双酯交换反应实现自动环化，但是在生成环状RNA的过程中也会产生大量的副产物，例如未成环的环状RNA前体分子以及被剪切下来的内含子片段等。目前，主流的富集纯化环状RNA的方法是利用Rnase R进行处理，但Rnase R在性质上不稳定，不同批次酶的差异性大，易导致环状RNA纯化富集效果不稳定；而且Rnase R不仅能消化线性RNA，还能消化部分环状RNA，导致环状RNA纯化富集过程中部分环状RNA的丢失。因此，对于纯化富集环状RNA，需要尽量缩短Rnase R的处理时间以减少环状RNA的损失，在提高环状RNA的富集效率的同时提高产物的纯度，最终在转染细胞时降低其带来的细胞毒性。/>[0003]M.Puttaraju等在Group I permuted intron
‑
exon(PIE)sequences self
‑
splice to produce circular exon中报道了通过I型内含子的设计实现环状RNA的制备，WO2019236673A1记载了一种用于在真核细胞中翻译的环状RNA，并对制备此种环状RNA使用的载体进行了描述，能够实现环状RNA的制备，但均无法解决上述纯化富集环状RNA的同时缩短Rnase R处理时间、提高环状RNA的富集效率、降低细胞毒性的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的一个目的在于提供一种用于制备环状RNA的载体。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供一种环状RNA前体分子。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供所述环状RNA前体分子的制备方法。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供所述载体在制备环状RNA中的应用。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供一种环状RNA的制备方法。
[0009]本专利技术通过在载体中设计可以转录为环状RNA前体分子多聚A尾的DNA序列，完成引入多聚A尾的环状RNA前体分子的制备，可在制备环状RNA过程中，解决环状RNA富集效率、环状RNA产物纯度和/或转染细胞后带来的细胞毒性等问题。
[0010]具体而言，一方面，本专利技术提供了一种用于制备环状RNA的载体，其包含能够转录为环状RNA前体分子的DNA序列，所述环状RNA前体分子的3
’
端带有多聚A尾。
[0011]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的用于制备环状RNA的载体中，所述的多聚A尾，长度为5～150个A。具体地，所述多聚A尾长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150个A。
[0012]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的用于制备环状RNA的载体，包含以下顺序排列的元件：
[0013]Anabaena pre
‑
tRNA 3
’
I型内含子片段；
[0014]内部核糖体进入位点(IRES)；
[0015]蛋白质编码区或非编码区；
[0016]Anabaena pre
‑
tRNA 5
’
I型内含子片段；
[0017]能转录为所述多聚A尾的DNA序列。
[0018]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的用于制备环状RNA的载体，还可包含以下元件中的一种或多种：
[0019]5’
同源臂；插入在所述的Anabaena pre
‑
tRNA 3
’
I型内含子片段中(可以是在型内含子片段序列的中间，或是靠近5
’
的位置)；
[0020]5’
间隔子序列；在所述的Anabaena pre
‑
tRNA 3
’
I型内含子片段与所述的内部核糖体进入位点之间；
[0021]3’
间隔子序列；在所述的蛋白质编码区或非编码区与在所述的Anabaena pre
‑
tRNA 5
’
I型内含子片段之间；
[0022]3’
同源臂；插入在所述的Anabaena pre
‑
tRNA 5
’
I型内含子片段中(可以是在型内含子片段序列的中间，或是靠近3
’
的位置)。
[0023]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的用于制备环状RNA的载体中，所述Anabaena pre
‑
tRNA 3
’
I型内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、蛋白质编码区或非编码区、Anabaena pre
‑
tRNA 5
’
I型内含子片段、5
’
同源臂、5
’
间隔子序列、3
’
间隔子序列、3
’
同源臂的具体序列可各自采用所属领域的已知片段序列。例如可采用WO2019236673A1记载的片段或非编码区。
[0024]根据本专利技术的一些具体实施方案，本专利技术的用于制备环状RNA的载体中，所述A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于制备环状RNA的载体，其包含能够转录为环状RNA前体分子的DNA序列，所述环状RNA前体分子的3
’
端带有多聚A尾。2.根据权利要求1所述的用于制备环状RNA的载体，其中，所述的多聚A尾，长度为5～150个A。3.根据权利要求1或2所述的用于制备环状RNA的载体，所述载体包含以下顺序排列的元件：Anabaena pre
‑
tRNA 3
’
I型内含子片段；内部核糖体进入位点(IRES)；蛋白质编码区或非编码区；Anabaena pre
‑
tRNA 5
’
I型内含子片段；能转录为所述多聚A尾的DNA序列。4.根据权利要求3所述的用于制备环状RNA的载体，所述的载体还包含以下元件中的一种或多种：5
’
同源臂；插入在所述的Anabaena pre
‑
tRNA 3
’
I型内含子片段中；5
’
间隔子序列；在所述的Anabaena pre
‑
tRNA 3
’
I型内含子片段与所述的内部核糖体进入位点之间；3
’
间隔子序列；在所述的蛋白质编码区或非编码区与所述的Anabaena pre
‑
tRNA 5
’
I型内含子片段之间；3
’
同源臂；插入在所述的A...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡勇，吕彬，
申请(专利权)人：深圳市瑞吉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：