一种陆地棉遗传转化体系的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种陆地棉遗传转化体系的构建方法，属于植物再生植株的培养技术领域。具体公开了一种陆地棉体细胞胚发生体系的构建方法，包括：将陆地棉下胚轴依次接入MS1(1)培养基、MS1(2)培养基和MS1(3)培养基诱导培养，获得愈伤组织；将愈伤组织用MS2(1)培养基和MS2(2)培养基交替进行继代培养，获得初生胚性愈伤组织；将初生胚性愈伤组织转接到MS3培养基增殖培养，获得增殖胚性愈伤组织；将增殖胚性愈伤组织接入MS4培养基分化培养，获得完整植株；上述方法能够较好的诱导出陆地棉的胚性愈伤组织。还公开了依赖上述体细胞胚发生体系建立的遗传转化体系，拓宽了借助转基因技术对陆地棉品系进行分子育种的基因型范围。对陆地棉品系进行分子育种的基因型范围。对陆地棉品系进行分子育种的基因型范围。

【技术实现步骤摘要】
一种陆地棉遗传转化体系的构建方法


[0001]本专利技术涉及植物再生植株的培养
，特别是涉及一种陆地棉遗传转化体系的构建方法。

技术介绍

[0002]棉花种植是我国经济的重要支柱性产业，陆地棉是主要种植的棉花种类。近年来，枯萎病、黄萎病侵害、干旱等问题导致种植面积不断减少，陆地棉品系经多代繁育会出现品质退化的现象，因而培育出抗逆性强且优良的纤维品质成为陆地棉育种的主要目标。
[0003]棉花体细胞胚胎发生研究最早起源于二十世纪七十年代，Price和Smith首次建立克劳茨基棉细胞悬浮体系，从中得到了数个胚状体，但没有获得再生植株，而后Davidonis通过连续培养珂字310棉花子叶产生的愈伤组织最终获得了胚状体及再生植株。到目前为止已成功获得陆地棉、亚洲棉、雷蒙德氏棉、拟似棉、海岛棉、戴维逊氏棉、草棉等8个棉属种的体细胞胚胎发生及再生植株，已形成系统性的棉花体细胞胚胎发生的培养体系。
[0004]新疆是棉花主要种植地区，新疆自育的棉花品种已有许多获得体细胞胚胎发生，其中包括一些高品质、抗病性强、产量高等优质性状的棉花栽培品种。2010年，顾冉冉建立了XLZ33的再生体系，该品种具有较高的胚胎发生能力；2012年，焦天奇研究获得高产优质的XLZ42号的体细胞胚和再生植株；2018年，葛书娅利用具有抗虫高产的棉花XLZ45号建立了胚胎发生体系。
[0005]目前，由于缺乏稳定高效的遗传转化技术体系，棉花的基因功能研究以及通过分子手段进行种质创新受到极大限制。棉花组织培养过程中愈伤组织分化出胚性愈伤组织是棉花体胚发生中最关键也是最难的环节，究其根本原因是遗传基因的限制棉花体细胞胚胎发生。即基因型是棉花体细胞胚胎发生的主要决定因素。因此，研发不同基因型的棉花体细胞胚发生体系是借助转基因技术改良棉花品系的先决条件。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种陆地棉遗传转化体系的构建方法，以解决上述现有技术存在的问题，进一步拓宽了借助转基因技术对陆地棉品系进行分子育种的基因型范围。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0008]本专利技术分别提供一种陆地棉体细胞胚发生体系和一种陆地棉的遗传转化体系的构建方法。
[0009]技术方案一：一种陆地棉体细胞胚发生体系的构建方法，包括如下步骤：
[0010]步骤一：将陆地棉的下胚轴依次接入MS1(1)培养基、MS1(2)培养基和MS1(3)培养基进行诱导培养，获得愈伤组织；
[0011]其中，所述MS1(1)培养基、MS1(2)培养基和MS1(3)培养基均包括如下组分：KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgCl2、MgSO4、CaCl2、KI、H3BO3、MnSO4·
H2O、ZnSO4·
7H2O、Na2M0O4·
2H2O、CuSO4·
5H2O、CoCl2·
6H2O、FeSO4·
7H2O、Na2EDTA
·
2H2O、肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1、
gelrite、KT和2,4
‑
D；所述MS1(1)培养基、MS1(2)培养基和MS1(3)培养基按照继代次数逐步降低培养基中KT和2,4
‑
D两种激素的浓度；
[0012]步骤二：将步骤一获得的愈伤组织按照继代次数交替使用MS2(1)培养基和MS2(2)培养基进行继代培养，获得初生胚性愈伤组织；
[0013]其中，所述MS2(1)培养基包括：KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgCl2、MgSO4、CaCl2、KI、H3BO3、MnSO4·
H2O、ZnSO4·
7H2O、Na2M0O4·
2H2O、CuSO4·
5H2O、CoCl2·
6H2O、FeSO4·
7H2O、Na2EDTA
·
2H2O、肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1和gelrite；所述MS2(2)培养基包括KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgCl2、MgSO4、CaCl2、KI、H3BO3、MnSO4·
H2O、ZnSO4·
7H2O、Na2M0O4·
2H2O、CuSO4·
5H2O、CoCl2·
6H2O、FeSO4·
7H2O、Na2EDTA
·
2H2O、肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1和gelrite、NAA和KT；
[0014]步骤三：将步骤二获得的初生胚性愈伤组织转接到MS3培养基中，进行增殖培养，获得增殖胚性愈伤组织；
[0015]所述MS3培养基包括：KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgCl2、MgSO4、CaCl2、KI、H3BO3、MnSO4·
H2O、ZnSO4·
7H2O、Na2M0O4·
2H2O、CuSO4·
5H2O、CoCl2·
6H2O、FeSO4·
7H2O、Na2EDTA
·
2H2O、肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1、gelrite、天冬酰胺和谷氨酰胺；
[0016]步骤四：将步骤三所获得的增殖胚性愈伤组织接入MS4培养基中，进行分化培养，获得完整植株；
[0017]所述MS4培养基包括：KNO3、KH2PO4、MgCl2、MgSO4、CaCl2、KI、H3BO3、MnSO4·
H2O、ZnSO4·
7H2O、Na2M0O4·
2H2O、CuSO4·
5H2O、CoCl2·
6H2O、FeSO4·
7H2O、Na2EDTA
·
2H2O、肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1、gelrite、葡萄糖、天冬酰胺和谷氨酰胺。
[0018]进一步地，步骤一中MS1(1)培养基、MS1(2)培养基和MS1(3)培养基的使用间隔时间为20
‑
25d；步骤二中MS2(1)培养基、MS2(2)培养基的使用间隔时间为12
‑
18d。
[0019]进一步地，所述MS1(1)培养基为：所述MS1(1)培养基为：1.9g/LKNO3+1.65g/L NH4NO3+0.17g/L KH2PO4+0.75g/L MgCl2+0.37g/LMgSO4+0.332g/L CaCl2+0.83mg/L KI+6.2mg/L H3BO3+0.0169g/LMnSO4·
H2O+8.6mg/LZnSO4·
7H2O+0.25mg/LNa2M0O4·
2H2O+0.025mg/L CuSO4·
5H2O+0.025mg/L CoCl2·
6H2O+0.0278g/L FeSO4·
7H2O+0.0373g/L Na2EDTA
·
2H2O+0.1g/L肌醇+0.001g/L烟酸+0.001g/L维生素B6+0.01g/L维生素B1+1.8g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
CoCl2·
6H2O+0.0278g/L FeSO4·
7H2O+0.0373g/L Na2EDTA
·
2H2O+0.1g/L肌醇+0.001g/L烟酸+0.001g/L维生素B6+0.01g/L维生素B1+1.8g/L gelrite+30g/L葡萄糖+0.05mg/mL KT+0.05mg/mL 2,4
‑
D；所述MS1(3)培养基为：1.9g/L KNO3+1.65g/L NH4NO3+0.17g/L KH2PO4+0.75g/L MgCl2+0.37g/L MgSO4+0.332g/L CaCl2+0.83mg/L KI+6.2mg/L H3BO3+0.0169g/L MnSO4·
H2O+8.6mg/L ZnSO4·
7H2O+0.25mg/LNa2M0O4·
2H2O+0.025mg/L CuSO4·
5H2O+0.025mg/L CoCl2·
6H2O+0.0278g/L FeSO4·
7H2O+0.0373g/L Na2EDTA
·
2H2O+0.1g/L肌醇+0.001g/烟酸+0.001g/L维生素B6+0.01g/L维生素B1+1.8g/L gelrite+30g/L葡萄糖+0.025mg/mL KT+0.025mg/mL 2,4
‑
D。4.根据权利要求1所述的一种陆地棉体细胞胚发生体系的构建方法，其特征在于，所述MS2(1)培养基为：1.9g/L KNO3+1.65g/L NH4NO3+0.17g/LKH2PO4+0.75g/L MgCl2+0.37g/L MgSO4+0.332g/L CaCl2+0.83mg/L KI+6.2mg/L H3BO3+0.0169g/L MnSO4·
H2O+8.6mg/L ZnSO4·
7H2O+0.25mg/LNa2M0O4·
2H2O+0.025mg/L CuSO4·
5H2O+0.025mg/L CoCl2·
6H2O+0.0278g/L FeSO4·
7H2O+0.0373g/LNa2EDTA
·
2H2O+0.1g/L肌醇+0.001g/L烟酸+0.001g/L维生素B6+0.01g/L维生素B1+1.8g/Lgelrite+30g/L葡萄糖；所述MS2(2)培养基为：1.9g/L KNO3+1.65g/L NH4NO3+0.17g/L KH2PO4+0.75g/L MgCl2+0.37g/L MgSO4+0.332g/L CaCl2+0.83mg/L KI+6.2mg/L H3BO3+0.0169g/L MnSO4·
H2O+8.6mg/L ZnSO4·
7H2O+0.25mg/LNa2M0O4·
2H2O+0.025mg/L CuSO4·
5H2O+0.025mg/L CoCl2·
6H2O+0.0278g/L FeSO4·
7H2O+0.0373g/LNa2EDTA
·
2H2O+0.1g/L肌醇+0.001g/L烟酸+0.001g/L维生素B6+0.01g/L维生素B1+1.8g/L gelrite+30g/L葡萄糖+0.3mg/mL NAA+0.01mg/mL KT。5.根据权利要求1所述的一种陆地棉体细胞胚发生体系的构建方法，其特征在于，所述MS3培养基为：3.8g/L KNO3+1.65g/L NH4NO3+0.17g/L KH2PO4+0.75g/L MgCl2+0.37g/L MgSO4+0.332g/L CaCl2+0.83mg/L KI+6.2mg/L H3BO3+0.0169g/L MnSO4·
H2O+8.6mg/L ZnSO4·
7H2O+0.25mg/LNa2M0O4·
2H2O+0.025mg/L CuSO4·
5H2O+0.025mg/L CoCl2·
6H2O+0.0278g/L ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张霞，周静，曲延英，陈全家，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：