一种合成含有只有3条脂肪酸链的单磷酸类脂A的大肠杆菌制造技术

本发明专利技术公开了一种合成含有只有3条脂肪酸链的单磷酸类脂A的大肠杆菌，属于基因工程和生物工程领域。本发明专利技术敲除了大肠杆菌HW003基因组上编码次级酰基链转移酶基因lpxL、lpxP和lpxM。得到重组菌HWJ003，提供了一种相比野生型缺少1位磷酸、3位一级酰基链、2

【技术实现步骤摘要】
一种合成含有只有3条脂肪酸链的单磷酸类脂A的大肠杆菌


[0001]本专利技术涉及一种合成含有只有3条脂肪酸链的单磷酸类脂A的大肠杆菌，属于基因工程和生物工程领域。

技术介绍

[0002]大肠杆菌是类脂A生物合成研究中的革兰氏阴性模式菌，其类脂A合成始于UDP
‑
氨基葡萄糖乙酸酐(UDP
‑
GlcNAc)，经过三种可溶性酶LpxA、LpxC和LpxD的连续催化分别在C2和C3位添加一条3
‑
OH脂肪酸链，形成UDP
‑
二酰氨基葡萄糖(UDP
‑
Diacyl
‑
GlcN)，再经LpxH的水解作用形成Lipid X。一分子Lipid X和一分子UDP
‑
Diacyl
‑
GlcN经LpxB缩合为1
‑
磷酸双糖(Disaccharide
‑1‑
P)，并转移至细胞内膜内侧，再经LpxK催化C4'位磷酸化反应，形成Lipid IV
A
。接着，KdtA将两分子Kdo基团添加到C6
′
位，形成Kdo2
‑
Lipid IVA。Kdo2
‑
Lipid IVA再经过LpxL和LpxM的酰化反应形成Kdo2
‑
类脂A(Kdo2
‑
LipidA)。LpxK、KdtA、LpxL和LpxM均为内膜蛋白，催化位点在内膜内侧。LpxL在C2
′
位添加一条12C的次级酰基链，LpxM在C3
′
位添加一条14C的次级脂肪酸链。随后，核心糖在WaaC、WaaF等糖基转移酶的作用下连接到Kdo基团上，形成核心多糖
‑
类脂A，并经过膜转运蛋白MsbA的作用将其翻转到内膜外侧。O
‑
抗原在细胞质内合成并转运至周质空间，在WaaL的作用下连接至核心多糖
‑
类脂A，形成完整的LPS并经多种转运蛋白作用转运至外膜外侧。然而，完整的大肠杆菌类脂A分子量较大，ESI/MS鉴定其结构时可能产生较多的结构成分，且野生型大肠杆菌不能用来鉴定其他革兰氏阴性菌的类脂A酰基转移酶。已有报道指出可以通过敲除大肠杆菌基因组上编码DNA结合转录阻遏物的基因lacI，类脂A合成基因lpxM，并过表达庚糖基转移酶编码基因waaC和waaF以获得结构精细的类脂A。

技术实现思路

[0003]为了解决上述存在的技术问题，本专利技术在大肠杆菌W3110中敲除了基因组上编码三个类脂A次级酰基链转移酶的基因，并敲入了来源于沙门氏菌的编码类脂A3
‑
O
‑
脱酰酶的基因和来源于弗朗西斯菌的编码类脂A1
‑
磷酸酶的基因，提供一种缺少1位磷酸、3位一级酰基链、2
’
位次级酰基链和3
’
位次级酰基链，只含有3条脂肪酸链的单磷酸类脂A的大肠杆菌HWJ003，其中这3条脂肪酸链为2位一级酰基链，2
’
位一级酰基链和3
’
位一级酰基链。
[0004]本专利技术提供了一种类脂A结构精简的基因工程菌，所述基因工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，敲除了基因组上编码DNA结合转录阻遏物的基因lacI，三个编码类脂A次级酰基链转移酶的基因lpxL、lpxP和lpxM，过表达编码类脂A 3
‑
O
‑
脱酰酶的基因pagL和编码类脂A1
‑
磷酸酶的基因lpxE。
[0005]在一种实施方式中，所述lacI的序列的NCBI上登录号为"NP_414879.3"。
[0006]在一种实施方式中，所述lpxL、lpxP和lpxM的序列的NCBI上登录号依次为"NP_415572.1"、"NP_416879.4"和"NP_416369.1"。
[0007]在一种实施方式中，所述编码类脂A 3
‑
O
‑
脱酰酶的基因pagL的序列的NCBI上登录
号为NP_461188.1。
[0008]在一种实施方式中，所述编码类脂A1
‑
磷酸酶的基因lpxE的序列的NCBI上登录号为WP_003041686.1。
[0009]在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌W3110。
[0010]本专利技术提供了一种制备精简结构的类脂A的方法，所述方法的具体步骤如下：(1)将上述基因工程菌接种于培养基中，获得菌液；(2)收集菌体，Bligh
‑
Dyer混合体系提取类脂A。
[0011]在一种实施方式中，所述类脂A的结构为在野生型大肠杆菌类脂A的基础上缺少1位磷酸、3位一级酰基链、2
’
位次级酰基链和3
’
位次级酰基链，是只含有2位一级酰基链，2
’
位一级酰基链和3
’
位一级酰基链的单磷酸类脂A。
[0012]本专利技术还提供上述基因工程菌在鉴定编码类脂A次级酰基链转移酶的基因中的应用，所述应用为先利用表达载体在上述基因工程菌中表达编码类脂A次级酰基链转移酶的基因获得重组菌，并诱导表达、提取类脂A，再通过ESI/MS鉴定编码类脂A次级酰基链转移酶的基因。
[0013]在一种实施方式中，所述编码类脂A次级酰基链转移酶的基因选自革兰氏阴性菌。
[0014]在一种实施方式中，所述表达载体包括pBAD33。
[0015]在一种实施方式中，所述诱导表达的条件为将重组菌接种于培养基中，并利用诱导剂诱导表达。
[0016]在一种实施方式中，所述诱导剂包括阿拉伯糖。
[0017]在一种实施方式中，所述提取为利用Bligh
‑
Dyer混合体系提取类脂A。
[0018]本专利技术还提供上述基因工程菌在制备疫苗佐剂中的应用。
[0019]有益效果：
[0020]本专利技术的类脂A结构精简的基因工程菌，可以快速有效的鉴定其他菌株来源的编码类脂A次级酰基链转移酶的基因，也可以作为底盘菌株进行类脂A结构的进一步改造以制备疫苗佐剂。并且利用本专利技术的基因工程菌可以生物合成结构最简化的含有只有三条脂肪酸链的单磷酸类脂A。
附图说明
[0021]图1：HWJ003基因敲除流程图；X为目的基因lpxL、lpxP和lpxM。
[0022]图2：HWJ003敲除结果验证。
[0023]图3：HWJ003 lipidA样品的ESI/MS分析。
[0024]图4：HWJ003
‑
pBAD
‑
RS01045 lipidA样品的ESI/MS分析。
[0025]图5：A.副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ATCC33846的ESI/MS分析。B.副溶血弧菌VP_RS01045基因敲除株的ESI/MS分析。
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种类脂A结构精简的的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为出发菌株，敲除了基因组上编码DNA结合转录阻遏物的基因lacI，三个编码类脂A次级酰基链转移酶的基因lpxL、lpxP和lpxM，过表达编码类脂A 3
‑
O
‑
脱酰酶的基因pagL和编码类脂A1
‑
磷酸酶的基因lpxE。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述lpxL、lpxP和lpxM的序列的NCBI上登录号依次为"NP_415572.1"、"NP_416879.4"和"NP_416369.1"。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述lacI的序列的NCBI上登录号为"NP_414879.3"。4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述pagL来源于沙门氏菌和lpxE来源于弗朗西斯菌；pagL的序列的NCBI上登录号为"NP_461188.1"和lpxE的序列的NCBI上登录号为"WP_003041686.1"。5.根据权利要求1～4任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小元，季帆，檀昕，王震，郭勇，韩雅宁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：