在原核系统中同时增强目的蛋白质表达量和可溶性的方法技术方案

本发明专利技术公开了在原核系统中同时增强目的蛋白质表达量和可溶性的方法，所述方法是通过使用基于Vip3蛋白质信号肽序列或其局部序列的新型融合标签，引导目的蛋白质的表达。由这类融合标签和目的蛋白质的编码基因形成的融合基因与大肠杆菌分子伴侣Trigger factor基因或其在其他生物中的同源基因在同一原核表达系统中共表达，能增强目的蛋白质的表达量和可溶性。本发明专利技术的重要性在于发明专利技术了一类新型的融合标签，其能够显著增强目的蛋白的表达量，同时，这类标签能够与已知特定分子伴侣互作，从而在保障表达量的前提下，可预见的增强目的蛋白质的可溶性，避免了依靠对不同分子伴侣的逐一尝试，才能确定增强未知目的蛋白质可溶性的传统方案，极大地提高了效率。极大地提高了效率。极大地提高了效率。

【技术实现步骤摘要】
在原核系统中同时增强目的蛋白质表达量和可溶性的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体是涉及一种在原核系统中同时增强目的蛋白质表达量和可溶性的方法。

技术介绍

[0002]在利用原核系统表达重组目的蛋白质时，为了增加目的蛋白质的可溶性，防止包涵体的形成，可以利用多种可溶性标签调节，比如MBP(maltose
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binding protein)(di Guanetal.1988；Kapust and Waugh，1999)标签，GST(glutathione
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S
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transferase)(Smith and Johnson，1988)标签、SUMO(small ubiquitin related modifier)(Butt et al.2005；Marblestone et al.2006)、NusA(N
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utilization substance)(Davis et al.1999)标签和Trx(Thioredoxin)(Lavallie et al.1993)等。这类标签连接到目的蛋白质N端后，能够增加目的蛋白质溶解性，进而促使其更易形成正确的空间结构。有些标签还能增加目的蛋白的表达量。当然，不同标签对不同目的蛋白质表达的正效应差异较大，且目前不能预判特定的融合标签对哪种蛋白质有效促溶，均需要实验证明，因此开发新型的标签具有很好的应用前景。
[0003]细菌分泌信号肽(signal peptide，SP)能够将目的蛋白质转运到革兰氏阴性菌的周质空间或细菌的细胞外侧。在表达目的蛋白质时，使用信号信号肽能够防止目的蛋白质，尤其是毒性蛋白在胞内过度积累导致的细胞毒性，或者避免胞内蛋白酶对重组目的蛋白质的非预期降解，从而提高目的蛋白质的表达量。另外，部分目的蛋白质在细菌周质空间或保外能够更好的折叠，因此，分泌信号肽作为融合标签使用，还可以改善部分重组目的蛋白质的可溶性表达。
[0004]大部分分泌信号肽具备3个经典的区域，从N端到C端，依次为N
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region，亲水性较强，净正电荷；H
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region，疏水性较强；C
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region，疏水性减弱。绝大多数分泌信号肽在转运过程中或转运后，会被相应的信号肽酶去除。本专利技术使用一种新型融合标签，即来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的分泌性杀虫蛋白Vip3(Estruch et al.1996；Crickmore et al.2020)的分泌信号肽(Vip3 signal peptide，Vsp)。该信号肽的最大特点是没有分泌信号肽的识别位点，因此，Vip3蛋白跨膜转运后依然携带其分泌信号肽。这一特点使其能够在多肽翻译完毕后，仍然能对重组目的蛋白质的可溶性和空间结构产生影响。
[0005]本专利技术利用Vsp(Doss et al.2002；Chen et al.2003；Rang et al.2005；Chakroun et al.2016)或其局部序列作为融合标签，引导目的蛋白质，能够显著增加其表达量。另外，Vsp的局部序列，即N
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region(VspN)、H
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region(VspH)和C
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region(VspC)及其不同的组合，比如VspNH、VspNC、VspHC，均能够提高重组目的蛋白质的表达量。其中，VspN本身具有较高的亲水性和净正电荷，因此，还能够促进目的蛋白质的可溶性。而VspH和VspC的疏水性较强，因此这两段区域分别或同时存在时，对目的蛋白质的可溶性具有负面影响。但是本专利技术发现，Vsp或其局部序列均能够被分子伴侣Trigger factor(TF)(De Geyter et al.2020)特异性识别，即只要将Trigger factor与含有Vsp信号肽或其局部序列的目的蛋
白质共表达，其可溶性就能显著或完全恢复。
[0006]Trigger factor、dnaK
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dnaJ
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grpE、groES
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groEL等分子伴侣在原核表达系统中，常与重组目的蛋白质共表达，从而改善目的蛋白质的可溶性。但是，目前尚不能预测哪种目的蛋白质与特定的分子伴侣互作，并产生促溶效果。通常，需要逐一尝试，比如日本Takara公司的Chaperone Plasmid Set，也是提供多种分子伴侣的共表达方案，让用户逐一，降低了工作效率。
[0007]本专利技术的重要性在于提出一类新的融合标签用于提高目的蛋白质在原核系统中的表达量，同时明确了Trigger Factor对这类标签引导的重组目的蛋白质的特异性作用，使用户可以预期目的蛋白质表达量的同时，也能预测最终产物的可溶性，极大的提高了工作效率。

技术实现思路

[0008]本专利技术解决的技术问题是提供了在原核系统中同时增强目的蛋白质表达量和可溶性的方法，使用编码Vip3蛋白质信号肽序列或其局部序列或这些多肽序列的突变体或相应的人工模拟多肽序列的多聚核苷酸序列作为新型融合标签，与编码目的蛋白质的多聚核苷酸序列形成一个融合基因。这些融合基因在原核系统中的表达量显著提高。将该融合基因与大肠杆菌分子伴侣Trigger factor基因或其在其他生物中的同源基因在同一原核表达系统中共表达，能增强目的蛋白质的表达量和可溶性。
[0009]本专利技术的技术方案如下：
[0010]首先，本专利技术提供的在原核系统中同时增强目的蛋白质表达量和可溶性的方法，是通过使用新型融合标签与目的蛋白形成融合蛋白质，所述新型融合标签包括Vip3蛋白质信号肽序列或其局部序列或这些多肽序列的突变体或相应的人工模拟多肽序列；将该融合蛋白质的编码基因与大肠杆菌分子伴侣Trigger factor基因或其在其他生物中的同源基因在同一原核系统中共表达，从而目的蛋白质的表达量和可溶性。
[0011]进一步地，在上述方案中，所述Vip3蛋白的信号肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1
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26所示，所述Vip3蛋白质信号肽序列的局部序列的氨基酸如SEQ ID NO:27
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32所示，本专利技术涉及的编码多肽序列的多核苷酸序列可根据遗传密码推理。密码子选择的偏好性也可根据宿主细胞类型的不同，进行调整。遗传密码及密码子选择的偏好性的知识是生物学领域中的基础知识，因此，多核苷酸序列能够通过本领域内熟知的常规分子生物学方法或化学合成方法制备。
[0012]进一步地，在上述方案中，所述Vip3蛋白质信号肽序列或其局部序列的突变体或相应的人工模拟多肽序列的关键突变或模拟原则是：第一是原多肽序列中的赖氨酸和精氨酸可进行互换，但这两种碱性氨基酸总体数量只可增加，不能减少，第二是指除了原来序列中相应位点的赖氨酸和精氨酸以外的其他位点的氨基酸可替换为碱性氨基酸或其他R基非疏水性氨基酸。这里的其他指的是除了原来序列中相应位点的赖氨酸和精氨酸以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.在原核系统中同时增强目的蛋白质表达量和可溶性的方法，其特征在于，是通过使用编码Vip3蛋白质信号肽序列或其局部序列或这些多肽序列的突变体或相应的人工模拟多肽序列的多聚核苷酸序列作为新型融合标签，与编码目的蛋白质的多聚核苷酸序列形成一个融合基因，将该融合基因与大肠杆菌分子伴侣Trigger factor基因或其突变体或该基因在其他生物中的同源基因在同一原核表达系统中共表达，能增强目的蛋白质的表达量和可溶性。2.根据权利要求1所述的在原核系统中同时增强目的蛋白质表达量和可溶性的方法，其特征在于，所述Vip3蛋白质信号肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1
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26所示，所述Vip3蛋白质信号肽序列的局部序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:27
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32所示，编码这些多肽序列的多聚核苷酸序列可按照生物学中的遗传密码表推算。3.根据权利要求1所述的在原核系统中同时增强目的蛋白质表达量和可溶性的方法，其特征在于，所述Vip3蛋白质信号肽序列或其局部序列的突变体或相应的人工模拟多肽序列的关键突变或模拟原则是：第一是原多肽序列中的赖氨酸和精氨酸可进行互换，但这两种碱性氨基酸总体数量只可增加，不能减少，第二是指除了原来序列中相应位点的赖氨酸和精氨酸以外的其他位点的氨基酸可替换为碱性氨基酸或其他R基非疏水性氨基酸。4.根据权利要求1所述的在原核系统中同时增强目的蛋白质表达量和可溶性的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：高建华，欧阳春平，赵娟丽，王兴春，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：