一种提高灵敏度的胶体金标记方法及其应用和产品技术

本发明专利技术提供了一种提高灵敏度的胶体金标记方法及其应用和产品，涉及免疫层析技术领域。本发明专利技术提供的胶体金标记方法，将用蛋白质活化剂处理的待标记蛋白与胶体金溶液混匀进行标记反应，得到金标蛋白。其中，蛋白质活化剂包括非离子型表面活性剂、糖类保护剂和还原剂，通过组分之间的协同配合，有效降低了金标结合物之间的相互作用，避免聚集，提升了金标结合物的稳定性，保护蛋白活性；胶体金溶液的pH低于待标记蛋白等电点0.3

【技术实现步骤摘要】
一种提高灵敏度的胶体金标记方法及其应用和产品


[0001]本专利技术涉及免疫层析
，尤其是涉及一种提高灵敏度的胶体金标记方法及其应用和产品。

技术介绍

[0002]胶体金与蛋白质主要依靠三种作用力结合：静电作用力、疏水作用力和金硫键。胶体金在不同pH下与蛋白质结合的主要作用力不同，从而影响标记效率和结合物的稳定性。
[0003]当pH值低于蛋白质的等电点时，静电作用为主要作用力，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，蛋白质极易与胶体金结合，形成的结合物相互之间容易聚集，出现死金的现象，标记效率高但形成的结合物稳定性差。
[0004]当pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥，此时主要依靠疏水作用相互结合。随着pH的提高，静电排斥增加，疏水作用力由于蛋白与金颗粒在空间距离上的增大而变小，结合到胶体金上的蛋白也减少，标记效率低。
[0005]当pH值等于或略高于蛋白质等电点时，蛋白质所带正电荷总数与负电荷总数相同，整体呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但疏水作用最强，在疏水作用力下蛋白质吸附于金颗粒的表面。由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，此时标记效率与结合物的稳定性达到一种较好的平衡。此方法被大多数技术人员广泛使用。
[0006]因此胶体金标记通常将胶体金溶液pH值调节至比蛋白质等电点高0.5左右，以保证标记物状态的稳定，但标记效率不高，标记结合物的活性未完全展现，所制备的试剂盒灵敏度也相对较低。
[0007]CN 102183633提供了一种胶体金标记方法，该方法在酸性环境中标记蛋白，再缓慢复碱以提升标记物的稳定性。该方法虽然一定程度上提升了标记效率，但标记时需将标记物冷却载缓慢复碱，操作较为复杂；且复碱前的胶体金
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蛋白质结合物由于在酸性环境中，静电引力强，易交联死金，从而导致胶体金的聚集，即使复碱后聚集的结合物也无法重新分散复溶，总体效率并不高。
[0008]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0009]本专利技术的第一目的在于提供一种胶体金标记方法，以解决上述问题中的至少一种。
[0010]本专利技术的第二目的在于提供上述胶体金标记方法在胶体金免疫层析试纸中的应用。
[0011]本专利技术的第三目的在于提供一种金标结合物。
[0012]本专利技术的第四目的在于提供一种试纸条。
[0013]本专利技术的第五目的在于提供一种试剂盒。
[0014]第一方面，本专利技术提供了一种胶体金标记方法，将预处理的待标记蛋白与胶体金溶液混匀进行标记反应，得到金标蛋白；
[0015]所述预处理包括用蛋白质活化剂处理待标记蛋白；
[0016]所述蛋白质活化剂包括非离子型表面活性剂、糖类保护剂和还原剂；
[0017]所述非离子型表面活性剂包括Triton X
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100、ON
‑
870、Tween
‑
20、Tween
‑
80、Brij
‑
35和Chemal LA9中的至少一种；
[0018]所述糖类保护剂包括葡聚糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖和乳糖中的至少一种；
[0019]所述还原剂包括抗坏血酸、柠檬酸和酒石酸中的至少一种；
[0020]所述胶体金溶液的pH低于待标记蛋白等电点0.3
‑
0.8。
[0021]作为进一步技术方案，所述非离子型表面活性剂的质量终浓度为0.005％
‑
0.1％；
[0022]优选地，所述糖类保护剂的质量终浓度为0.01％
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1％；
[0023]优选地，所述还原剂的质量终浓度为0.01％
‑
1％。
[0024]作为进一步技术方案，所述蛋白质活化剂包括以下组分：质量终浓度为0.005％
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0.1％的ON
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870、质量终浓度为0.01％
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1％的海藻糖和质量终浓度为0.01％
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1％的酒石酸；
[0025]优选地，所述ON
‑
870的质量终浓度为0.05％；
[0026]优选的，所述海藻糖的质量终浓度为0.2％；
[0027]优选的，所述酒石酸的质量终浓度为0.1％。
[0028]作为进一步技术方案，所述待标记蛋白包括新型冠状病毒N抗体、腺病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、甲型流感抗体、乙型流感抗体和抗人IgM抗体。
[0029]作为进一步技术方案，所述标记反应的时间为25
‑
35min，优选为30min。
[0030]作为进一步技术方案，标记反应后还包括添加封闭剂的步骤；
[0031]优选地，封闭的时间为10
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20min；
[0032]优选地，所述封闭剂包括牛血清白蛋白。
[0033]第二方面，本专利技术提供了一种胶体金标记方法在制备胶体金免疫层析产品中的应用；
[0034]所述产品包括检测试剂、试纸条和试剂盒。
[0035]第三方面，本专利技术提供了一种金标结合物，采用上述胶体金标记方法制备得到。
[0036]第四方面，本专利技术提供了一种试纸条，包括上述金标结合物。
[0037]第五方面，本专利技术提供了一种试剂盒，包括上述试纸条。
[0038]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0039]本专利技术提供的胶体金标记方法，将用蛋白质活化剂处理待标记蛋白与胶体金溶液混匀进行标记反应，得到金标蛋白。其中，蛋白质活化剂包括非离子型表面活性剂、糖类保护剂和还原剂，非离子型表面活性剂不存在离子基团，在溶液中不解离，与蛋白质主要以疏水力发生相互作用，亲水端则与其他疏水基团接触，竞争性抑制蛋白质与其他疏水基团接触，同时蛋白质的二硫键在还原剂的作用下被打开，在非离子型表面活性剂和还原剂的协同作用下，蛋白质结构发生改变，所带正电荷总数降低，蛋白质与胶体金间的静电引力减弱，从而降低了金标结合物之间的相互作用和聚集，提升了金标结合物的稳定性；糖类保护剂含有大量羟基，可与蛋白质形成氢键，同时增加了溶液的粘度，达到保护蛋白活性的效果；胶体金溶液的pH低于待标记蛋白等电点0.3
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0.8，在低于蛋白等电点的条件下标记蛋
白，形成的金标结合物稳定性好，标记效率高。该方法操作简便，制备得到的金标结合物标记效率高，稳定性好，所制备得到的试剂盒灵敏度高，不易漏检，较CN 102183633提供的标记方法操作简便，无需复碱，标记效率高，重复性好易于放大。
具体实施方式
[0040]下面将结合实施方式和实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的实施例，本领本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高灵敏度的胶体金标记方法，其特征在于，将预处理的待标记蛋白与胶体金溶液混匀进行标记反应，得到金标蛋白；所述预处理包括用蛋白质活化剂处理待标记蛋白；所述蛋白质活化剂包括非离子型表面活性剂、糖类保护剂和还原剂；所述非离子型表面活性剂包括Triton X
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100、ON
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870、Tween
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20、Tween
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80、Brij
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35和Chemal LA9中的至少一种；所述糖类保护剂包括葡聚糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖和乳糖中的至少一种；所述还原剂包括抗坏血酸、柠檬酸和酒石酸中的至少一种；所述胶体金溶液的pH低于待标记蛋白等电点0.3
‑
0.8。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂的质量终浓度为0.005％
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0.1％；优选地，所述糖类保护剂的质量终浓度为0.01％
‑
1％；优选地，所述还原剂的质量终浓度为0.01％
‑
1％。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质活化剂包括以下组分：质量终浓度为0.005％
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0.1％的ON
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：魏鹏海，朱兆奎，储寒君，梁权，张淑芳，
申请(专利权)人：上海伯杰医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：