靶向CD1D的单域抗体制造技术

本发明专利技术涉及复合物，具体涉及与非经典MHC蛋白CD1d特异性结合并调节CD1d介导的生物功能的多肽。本发明专利技术具体涉及包含至少一种单域抗体或由至少一种单域抗体组成的这样的复合物和多肽，其中至少一种单域抗体特异性结合CD1d。本发明专利技术还提供了使用这种复合物、多肽和/或单域抗体的方法和用途。或单域抗体的方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
靶向CD1D的单域抗体
[0001]本申请是申请日为2016年1月27日、中国专利申请号为201680007612.0且专利技术名称为“靶向CD1D的单域抗体”的中国专利申请的分案申请，并且本申请要求享有荷兰(NL)申请第2014192号的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。


[0002]本专利技术总体上涉及免疫学领域，更具体地涉及与人CD1d结合的单域抗体领域，包括改变CD1d介导的生物学功能的抗体，所述CD1d介导的生物学功能包括例如CD1d限制性T细胞(包括自然杀伤T(NKT)细胞)的活化和调节表达CD1d的细胞的功能。例如，提供包含至少一种与CD1d结合的单域抗体的复合物(compound)、这种包含至少一种单域抗体的复合物的用途和包含这种复合物的(药物)组合物。

技术介绍

[0003]CD1d是在各种人细胞(包括抗原呈递细胞(APC))表面上表达的CD1(分化群1)族糖蛋白(包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和CD1e)的成员之一。人CD1d由CD1D编码，也称为R3G1。展示CD1d的APC包括朗格汉斯细胞、(活化的)B细胞、树突细胞(例如在淋巴结中)和(活化的)血液单核细胞。CD1d也由各种其它细胞类型表达，例如在肝脏、胰腺、皮肤、肾脏、子宫、结膜、附睾、胸腺和扁桃体中(参见例如Canchis et al.(1992)Immunology 80:561
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565)。
[0004]通过CD1d活化/刺激的细胞包括自然杀伤T细胞(NKT细胞)。NKT细胞是具有T细胞和自然杀伤细胞二者的特性的T细胞的异质组。NKT细胞是表达α/βT细胞受体(TCR)以及多种分子标记的T细胞的亚群，所述多种分子标记通常与NKT细胞相关。
[0005]1型NKT细胞或恒定型NKT细胞是最著名的NKT细胞组，其与常规αβT细胞的不同之处在于它们的T细胞受体在多样性(“恒定”)方面受到更大的限制。包括这些恒定型NKT细胞和其它CD1d限制性T细胞(2型NKT)在内的NKT细胞识别由APC上存在的CD1d分子呈递的(自身或外源的)脂质和糖脂。(脂质呈递)CD1d和TCR之间的相互作用触发细胞因子的释放，细胞因子包括Th1样细胞因子或Th2样细胞因子，如干扰素
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γ，肿瘤坏死因子
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α和白细胞介素如IL
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4、IL
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5和IL
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13。
[0006]已经证实不同的脂质能结合CD1d分子，包括分支菌酸、二酰基甘油和鞘脂。α
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半乳糖神经酰胺KRN7000是体外和体内NKT细胞活化中脂质结合CD1d的最佳研究配体。其它配体包括异环球三己糖基神经酰胺、(微生物衍生的)葡糖醛酰基神经酰胺、α
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C
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半乳糖神经酰胺、苏糖醇神经酰胺和各种(人和非人)糖脂，如溶血磷脂酰胆碱和溶血鞘磷脂蛋白(参见例如Fox et al(2009)PLOS Biology 7:10:e1000228)。
[0007]现已证明NKT细胞在调节自身免疫、过敏、抗微生物和抗肿瘤免疫应答中的重要作用(van der Vliet et al.(2004)Clinical Immunology 112(1):8
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23)。在生理学上，NKT细胞可以通过依赖于环境的多种机制来增强或抑制包括抗肿瘤、自身免疫和抗病原体反应在内的免疫应答(Yue et al.(2010)The Journal of Immunology 184:268
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276)，所述机理包括诱导多发性骨髓瘤细胞的细胞死亡。可能涉及NKT细胞的病症包括自身免疫性或炎
性疾病，包括重症肌无力、牛皮癣、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性肝硬化、结肠炎、自身免疫性肝炎、动脉粥样硬化和哮喘。除了细胞因子释放之外，导致细胞溶解的NKT细胞效应子功能(如穿孔素释放和颗粒酶释放和细胞死亡)也可能与涉及NKT细胞的病症(例如癌症)有关。因此，调节CD1d介导的作用具有潜在的疗效。
[0008]一直需要能够尽可能特异性地结合CD1d和/或与CD1d相互作用的复合物，即同时在体外和体内最低限度地结合或不结合CD1家族的其它家族成员。特别需要这样的复合物，其结合和/或调节(活化或抑制)涉及CD1d的生物学功能，例如但不限于NKT细胞活化。这样的复合物可以例如在CD1d介导的功能起作用的各种疾病中显示益处。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供了包含至少一种单域抗体的复合物。所述单域抗体与人CD1d结合。与人CD1d结合的单域抗体包含具有本文公开的氨基酸序列的CDR1、CDR3和CDR3区及其保守序列变体。
[0010]优选地，所述单域抗体具有本文公开的(例如表1中所示的)CDR1、CDR2和CDR3区域的组合。
[0011]更优选地，单域抗体具有选自SEQ ID NO:1
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SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
[0012]本专利技术的复合物可以是任何种类的复合物，例如一种复合体，只要与人CD1d结合的单域抗体包含在该复合物中即可。优选地，所述复合物是多肽。在某些实施方案中，复合物可以仅由与人CD1d结合的单域抗体组成。在其它实施方案中，复合物由与人CD1d结合的单域抗体和标记物组成。在其它实施方案中，复合物可以包含与人CD1d结合的单域抗体，所述单域抗体连接至药物活性剂和/或其它抗体。
[0013]还提供了本专利技术复合物在医疗中的用途和/或作为诊断剂的用途。
[0014]还提供了包含本文公开的复合物的药物组合物、核苷酸序列和宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本专利技术复合物的核苷酸序列。
附图说明
[0015]图1：所选择的纳米抗体各自的CD1d特异性。使用流式细胞术检测同种型对照mAb(IgG2b)、抗CD1d 51.1单克隆抗体、R2阴性对照VHH和各CD1d特异性VHH的结合。数据表明结合至CD1a、CD1b、CD1c和CD1d转染的肿瘤细胞系(n＝3)。
[0016]图2：通过CD1d特异性纳米抗体诱导moDC成熟和细胞因子产生。将未成熟的moDC与CD1d特异性纳米抗体一起培养。24小时后，收集上清液以检测细胞因子产生(ELISA)。72小时后，使用流式细胞术分析moDC的成熟标记物CD83的细胞表面表达。NC＝阴性对照，PC＝阳性对照，IgG2b＝同种型对照单克隆抗体，51.1＝抗CD1d 51.1单克隆抗体，LPS＝脂多糖，LPS
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PMB＝具有多粘菌素B的脂多糖。数据表示平均值+SEM，n＝3。
[0017]图3：α
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GalCer诱导的iNKT细胞活化的抑制。将CD1d转染的HeLa细胞与载体对照(veh)或α
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GalCer一起脉冲处理(pulsed)过夜(所有其它条件)。洗涤后，将经载体或α
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GalCer脉冲处理的HeLa
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.包含与人CD1d结合并能够诱导CD1d限制性T细胞活化的抗体的复合物在制备用于治疗癌症的药物中用途。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述复合物能够活化恒定型自然杀伤T细胞。3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述复合物能够刺激糖脂诱导的恒定型自然杀伤T细胞的活化。4.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述复合物能够刺激α
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半乳糖神经酰胺诱导的恒定型自然杀伤T细胞的活化。5.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述复合物包括单域抗体。6.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述复合物包含单域抗体并且其中所述单域抗体包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列。7.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述复合物包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。8.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述复合物包含其他单域抗体。9.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述复合物是双特异性或多特异性复合物。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复合物与另一种抗体连接。11.包含与人CD1d结合的至少一种单域抗体的复合物，其中所述单域抗体包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包含与SEQ ID NO:22具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，CDR2包含与SEQ ID NO:43具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。12.包含与人CD1d结合的至少一种单域抗体的复合物，其中所述单域抗体包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中a)CDR1包含与SEQ ID NO:22具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，CDR2包含与SEQ ID NO:43具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，CDR3包含与SEQ ID NO:64具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列；或者b)CDR1包含选自SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:42的氨基酸序列，CDR2包含选自SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:63的氨基酸序列，CDR3包含选自SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:84的氨基酸序列。13.包含与人CD1d结合的至少一种单域抗体的复合物，其中所述单域抗体具有如表1中组合列出的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3或其保守序列变体。14.根据权利要求11
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13中任一项所述的复合物，其中所述复合物包含选自SEQ ID NO:1
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SEQ ID NO:21的氨基酸序列或其保守序列变体。15.根据权利要求11
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14中任一项所述的复合物，其中所述复合物为多肽。16.根据权利要求11
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15中任一项所述的复合物，其中所述复合物包含其它单域抗体，其中所述复合物包含标记物，其中药物活性剂与所述复合物连接，其中所述单域抗体为人源化的，其中所述复合物为双特异性或多特异性复合物，其中所述复合物为二价或多价复合物，其中所述复合物与抗原、肽或核苷酸序列融合，其中所述复合物为脂质体，其中所述复合物为病毒，和/或其中所述复合物为纳米颗粒。
17.根据权利要求11
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16中任一项所述的复合物，其中所述单域抗体与人CD1d结合，但不与人CD1a、人CD1b和/或人CD1c结合；优选所述复合物与人CD1d结合，但不与人CD1a、人CD1b和/或人CD1c结合。18.根据权利要求11
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17中任一项所述的复合物，其中a)所述复合物能够诱导树突细胞的成熟和/或诱导由树突细胞产生细胞因子，优选诱导由单核细胞衍生的树突细胞产生细胞因子，优选地，其中单域抗体具有在表1中组合列出的、VHH2或VHH5的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3或其保守序列变体；和/或b)所述复合物能够抑制糖脂，例如α
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半乳糖神经酰胺，诱导的CD1d限制性T细胞活化，包括恒定型自然杀伤T细胞的活化，优选地，其中所述单域抗体具有在表1中组合列出的、VHH5或VHH24的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3或其保守序列变体；和/或c)所述复合物能够诱导包括恒定型自然杀伤T细胞在内的C...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰内斯，
申请(专利权)人：拉法医疗公众有限公司，
类型：发明
国别省市：