一种三叶青块根内生菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种三叶青块根内生菌及其应用，特点是该菌为四川肠杆菌6D1（Enterobacter sichuanensis 6D1），于2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23610，具有产生长素、铁载体和溶磷特性，在促进三叶青块根发育方面、提高药用植物总黄酮含量方面、提高三叶青根部脂氧化酶LOX基因表达量方面和提高三叶青根部扩展蛋白Thexp基因表达量方面的应用，优点是促进三叶青块根生长和提高总黄酮含量。和提高总黄酮含量。和提高总黄酮含量。

【技术实现步骤摘要】
一种三叶青块根内生菌及其应用


[0001]本专利技术属于植物益生菌制剂领域，尤其涉及一种从中药三叶青块根中分离的肠杆菌（Enterobacter）在促进三叶青块根生长和提高总黄酮含量中的应用。

技术介绍

[0002]三叶青（Tetrastigma hemsleyanum）为葡萄科（Vitaceae）崖爬藤属（Tetrastigma）植物，全株可入药，其中块根药效最佳，具有清热解毒、活血止痛和祛风化痰等方面的功效。现代药理学研究表明，三叶青具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎镇痛、保肝等作用，且长期应用未见毒副作用，是西药无法代替的“植物抗生素”。临床上已广泛用于肝癌、肺癌、白血病及艾滋病等疾病的治疗。由于野生三叶青对生长环境要求比较苛刻，其分布范围较小，且自然条件下生长非常缓慢，野生资源较少。近些年，因市场需求量不断增加，野生资源过度采挖，生态环境破坏严重，三叶青资源匮乏。市场上三叶青价格不断攀升，供不应求。因此三叶青人工栽培技术迅速推广，江浙地区种植面积大大增加。由于三叶青栽培时间较长，一般需种植3
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5年才能采挖，且采挖劳动力等成本较大，人工栽培产量较低，因此需要进一步优化人工栽培技术，提高三叶青亩产量。
[0003]植物体内普遍存在着内生菌，研究表明植物内生菌可以分泌生长素、抗生素等代谢物质，这些代谢物质能促进植物生长或诱导植物产生抗性。因此，对植物施用植物内生菌产生的生长素、抗菌剂等，可促进植物生长、增强植物抗逆性，还能减少化学药剂对环境的污染，保证植物的产量和品质。因此研究能够促进三叶青生长内生菌，是当前解决三叶青产量低的有效途径之一。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有产生长素和溶磷特性的三叶青块根内生菌及其在促进三叶青块根生长和提高总黄酮含量中的应用。
[0005]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种三叶青块根内生菌，该菌为四川肠杆菌6D1（Enterobacter sichuanensis 6D1），于2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23610。该菌株为革兰氏阴性菌，在LB琼脂培养基上30℃培养24 h，菌落表面光滑，边缘整齐，为乳白色；采用Salkowski溶液显色法和铁载体检测培养基（CAS）定性检测发现该菌株具有较强产IAA和铁载体的能力；该菌株也具有较好的溶磷能力，接种于蒙金娜固体培养基上，置于30℃恒温培养箱培养5 d后，可形成透明圈。
[0006]上述三叶青块根内生菌在制备吲哚乙酸IAA方面的应用。
[0007]上述三叶青块根内生菌在制备铁载体方面的应用。
[0008]上述三叶青块根内生菌在提高土壤有效磷方面的应用。
[0009]上述三叶青块根内生菌在促进三叶青块根发育方面的应用。
[0010]上述三叶青块根内生菌在提高药用植物总黄酮含量方面的应用。
[0011]上述的三叶青块根内生菌在提高三叶青根部脂氧化酶LOX基因表达量方面的应用。
[0012]所述的三叶青根部脂氧化酶LOX基因的上下游扩增引物分别为：上游扩增引物LOX
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F：5
’‑ꢀ
TCC TTC AAA GAT TCA AGC AAC A
ꢀ‑3’
；下游扩增引物LOX
‑
R：5
’‑ꢀ
AAT GGC TTC AAG AGT TCA TAT G
‑3’
。
[0013]上述三叶青块根内生菌在提高三叶青根部扩展蛋白Thexp基因表达量方面的应用。
[0014]优先的所述的三叶青根部扩展蛋白Thexp基因的上下游扩增引物分别为：上游扩增引物Thexp
‑
F：5
’‑
CCC TGG TAG ATG GCG AAC TT
‑3’
；下游扩增引物Thexp
‑
R：5
’‑
AAC CGC CAC TAA TTT CTG CC
‑3’
。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术一种三叶青块根内生菌及其应用，该菌株具有较强的产IAA和铁载体能力，该菌株还具有较强的溶磷能力，其溶磷圈直径和菌落直径的比值为1.8；三叶青产生长素和溶磷特性的内生菌能有效促进三叶青生长，使用该菌株作为药用植物如三叶青的益生菌添加剂，可以显著增加三叶青的生物量和总黄酮含量，诱导块根发育基因表达；本专利技术筛选的Enterobacter sichuanensis 6D1菌株使用后不仅可以提高三叶青块根的产量和质量，还不会有环境污染、农药残留等化学农药常见问题，具有广阔的应用前景。
[0016]综上所述，本专利技术从三叶青块根中分离纯化得到1株具有产生长素和溶磷特性的内生细菌（命名为6D1），其具有促进三叶青块根生长和提高总黄酮含量的作用，以期本专利技术能进一步提升三叶青人工栽培技术，促进三叶青产业蓬勃发展。
[0017]上述三叶青内生菌，该菌株分类命名为四川肠杆菌6D1（Enterobacter sichuanensis 6D1），于2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23610，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
[0018]图1为本专利技术菌株产IAA和铁载体的定性检测；图2为本专利技术菌株在蒙金娜固体培养基上培养后产生的透明晕圈；图3 为本专利技术菌株对三叶青组培苗植株生长的影响；图4为本专利技术菌株应用对三叶青脂氧化酶和扩展蛋白基因表达的影响。
具体实施方式
[0019]以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。
[0020]实施例11、三叶青块根内生细菌的分离纯化取新鲜无病害的三叶青植物块根，先用流水冲洗30~60 min，70%乙醇浸泡1 min，再用含2~3滴吐温
‑
20的0.1wt%氯化汞溶液浸泡15 min，期间不断摇动，最后用无菌水清洗5次，用无菌滤纸吸干水分备用。在超净工作台中，用灭菌剪刀将块根剪碎，加入1 mL无菌磷酸缓冲液于无菌研钵中研磨成匀浆，吸取100 μL涂布于LB固体培养基上，于30℃倒置培养1
~2 d至菌落长出，挑取颜色、大小或形态不同的菌落在LB固体培养基表面划线纯化2次，共获得15株菌株。采用Salkowski溶液显色法和铁载体检测培养基（CAS）定性检测以上15种菌株产吲哚乙酸IAA和铁载体能力，筛选出一株产IAA和铁载体能力较强的菌株6D1用于后续实验（图1）。
[0021]所用的LB固体培养基配方为：酵母提取物 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L和氯化钠10 g/L，琼脂粉15 g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.0；Salkowski显色溶液配方为：将30 ml的浓硫酸溶于50 mL水中，再加入1.5 mL 0.5 mol/L FeCl3·
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三叶青块根内生菌，其特征在于该菌为四川肠杆菌6D1（Enterobacter sichuanensis 6D1），于2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23610。2.一种根据权利要求1所述的三叶青块根内生菌在制备吲哚乙酸IAA方面的应用。3.一种根据权利要求1所述的三叶青块根内生菌在制备铁载体方面的应用。4.一种根据权利要求1所述的三叶青块根内生菌在促进三叶青块根发育方面的应用。5.一种根据权利要求1所述的三叶青块根内生菌在提高药用植物总黄酮含量方面的应用。6.一种根据权利要求1所述的三叶青块根内生菌在提高三叶青根部脂氧化酶LOX基因表达量方面的应用。7.根据权利要求6所述的一种三叶青块根内生菌在提高三叶青根部脂氧化酶LOX基因表达量方面的应用，其特征在于所述的三叶青根部脂氧化酶LOX基因的上下游扩增引物分别为：上游扩增引物LOX
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【专利技术属性】
技术研发人员：洪春桃，章建红，沈登锋，魏斌，黄宗兴，蒋笑丽，
申请(专利权)人：宁波市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：