一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用，以植物矮牵牛作为研究对象，采用转录组测序和VIGS相结合的技术，首先构建TRV病毒侵染的差异表达基因数据库，从中选择极显著差异表达转录因子作为候选基因；分别构建至TRV

【技术实现步骤摘要】
一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用。

技术介绍

[0002]RNA沉默是植物抵抗病毒入侵的重要防御机制，该沉默机制需要多种关键酶基因的参与，包括DCLs、AGOs、RDRs、DRBs等，它们分别负责病毒dsRNA的识别与剪切、siRNA的形成与稳定、dsRNA的二次合成等过程。然而至今，针对这些酶基因表达起着重要调控作用的转录因子却少有报道。因此，采用何种技术挖掘RNA沉默通路关键转录因子是一个亟待解决的重要科学问题。
[0003]目前，上游转录因子的筛选多采用酵母单杂交技术，通过对酵母细胞内报告基因表达情况的分析来鉴别特定的DNA结合位点，帮助发现潜在的结合蛋白(即转录因子)。但是，该技术操作繁琐、成本偏高、灵敏度较差，目的基因片段可能会被漏检，有一定假阳性或假阴性的比率，且每次实验仅能针对单一基因进行筛选，难以筛选出同时调控同一途径中多个基因的转录因子。
[0004]基于RNA沉默的病毒防卫原理，科研人员开发出了一种下调基因表达的反向遗传学技术，即病毒诱导基因沉默(virus
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induced gene silencing,VIGS)。该技术以人工改造的病毒为载体，将目标基因片段构建其中，依靠农杆菌介导侵染后，可引起寄主植物体内同源基因表达水平的下降。VIGS技术具有操作简单、成本较低、便于表型快速观察等优势，现已发展成为高通量基因筛选与功能研究的强有力工具。r/>[0005]由于VIGS技术是抗病毒RNA沉默机理的一种外在应用形式，两者原理共通，VIGS沉默效率可以准确反映出RNA沉默程度，因此以模式植物矮牵牛为研究对象，以VIGS技术为实验手段，采用候选转录因子与报告基因联合构建方式，以可观察的报告基因沉默表型差异作为判断依据，是一种筛选调控抗病毒RNA沉默途径关键转录因子的新方法。专利技术人前期研究发现，将矮牵牛抗病毒RNA沉默正调控转录因子PhOBF1和PhERF2基因片段构建至TRV
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PhPDS载体中，侵染后导致光漂白表型受到抑制，提高了病毒积累量，并降低了RNA沉默通路中相关基因的表达水平，从而在理论和实践上证明了该方法的有效性。目前，该筛选方法还存在如下不足和缺陷：1)用于抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选的候选基因来源十分缺乏；2)在VIGS技术中用于监测抗病毒RNA沉默过程的报告基因类型尚待确定；3)以VIGS沉默表型为关键转录因子的判断依据仍然不够细化。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术不足与缺陷，本专利技术的目的在于，提供一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及其应用，解决了现有技术中存在的操作繁琐、成本偏高、灵敏度较差、筛选效率低下、针对基因单一等问题。
[0007]为了达到上述目的，本申请采用如下技术方案予以实现：
[0008]本专利技术公开一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，所述植物抗病毒RNA沉默相关转录因子包括植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子和植物抗病毒RNA沉默负调控转录因子，包括以下步骤：
[0009]步骤1：采用烟草脆裂病毒接种矮牵牛植株，接种后取样，利用转录组测序技术建立烟草脆裂病毒侵染的矮牵牛叶片差异表达基因数据库；
[0010]步骤2：从所述矮牵牛叶片差异表达基因数据库中选择极显著上调表达的转录因子和极显著下调表达的转录因子，排除非抗性相关基因，剩余作为候选转录因子；
[0011]步骤3：以烟草脆裂病毒为载体，绿色荧光蛋白和矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶基因为报告基因，将步骤2中所述候选转录因子的基因片段依次构建至烟草脆裂病毒
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绿色荧光蛋白
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矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶载体中，得到烟草脆裂病毒载体的重组质粒；
[0012]步骤4：将烟草脆裂病毒载体的重组质粒转化进农杆菌菌株中，利用农杆菌介导法注射接种矮牵牛小苗，观察接种后矮牵牛小苗叶片绿色荧光信号强度及系统叶片光漂白表型程度；
[0013]以绿色荧光和光漂白表型作为筛选依据，在上调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光增强、光漂白表型受到抑制的基因认定为植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子；在下调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光减弱、光漂白表型受到促进的基因认定为抗病毒RNA沉默负调控转录因子，完成筛选。
[0014]具体的，步骤1中采用烟草脆裂病毒接种矮牵牛植株具体包括：首先采集保存烟草脆裂病毒的活体植株叶片，研磨后加入磷酸缓冲液，过滤，制备病毒侵染液；
[0015]接着在4
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6叶期的矮牵牛植株幼嫩叶片表面撒上金刚砂，采用机械摩擦法，蘸取病毒侵染液，在叶片表面轻抹数次进行病毒接种。
[0016]具体的，所述磷酸缓冲液浓度为95～105mM，pH为6.8～7.2。
[0017]进一步的，步骤3具体包括：采用酶切连接法，首先将矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶基因片段构建至烟草脆裂病毒
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绿色荧光蛋白载体SacI、XhoI酶切位点之间，形成烟草脆裂病毒
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绿色荧光蛋白
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矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶载体，然后将候选转录因子的基因片段构建至载体的BamHI、KpnI酶切位点之间，得到烟草脆裂病毒载体的重组质粒。
[0018]具体的，步骤4中所述农杆菌菌株为GV3101。
[0019]具体的，步骤4中接种的矮牵牛小苗放在20℃光照时长15～17h，18℃黑暗时长7～9h条件下培养。
[0020]本专利技术还公开了植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法筛选得到的转录因子。
[0021]本专利技术还公开了采用所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法进行筛选植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子和植物抗病毒RNA沉默负调控转录因子的应用。
[0022]本专利技术与现有技术相比，有益的技术效果是：
[0023]本专利技术依据高通量的转录组学和VIGS瞬时沉默技术，在获得大量受病毒侵染差异表达的候选转录因子基因来源的基础上，进而通过VIGS方法开展目标转录因子筛选，并利用可视化的报告基因GFP和PhPDS引起的表型，同时监测病毒抗性和RNA沉默过程，与传统的酵母单杂交筛选方法相比，具有操作简便、成本低廉、筛选效率高、针对性强等优点，且容易筛选到调控单一或多个RNA沉默功能基因的关键转录因子。本专利技术可为获得植物抗病毒RNA
沉默相关转录因子，进一步解析基于RNA沉默的抗病毒转录调控机制提供崭新途径。
附图说明
[0024]图1为植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选示意图。
[0025]图2为用于转录组测序的TRV病毒侵染不同时期矮牵牛叶片，即野生型矮牵牛植株接种TRV病毒0(S0)、3(S3)、6(S6)天的叶片症状。
[0026]图3为TRV病毒侵染的矮牵牛差异表达基因数量统计；(a)TRV病毒接种不同时期差异表达基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，所述植物抗病毒RNA沉默相关转录因子包括植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子和植物抗病毒RNA沉默负调控转录因子，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：采用烟草脆裂病毒接种矮牵牛植株，接种后取样，利用转录组测序技术建立烟草脆裂病毒侵染的矮牵牛叶片差异表达基因数据库；步骤2：从所述矮牵牛叶片差异表达基因数据库中选择极显著上调表达的转录因子和极显著下调表达的转录因子，排除非抗性相关基因，剩余作为候选转录因子；步骤3：以烟草脆裂病毒为载体，绿色荧光蛋白和矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶基因为报告基因，将步骤2中所述候选转录因子的基因片段依次构建至烟草脆裂病毒
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绿色荧光蛋白
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矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶载体中，得到烟草脆裂病毒载体的重组质粒；步骤4：将烟草脆裂病毒载体的重组质粒转化进农杆菌菌株中，利用农杆菌介导法注射接种矮牵牛小苗，观察接种后矮牵牛小苗叶片绿色荧光信号强度及系统叶片光漂白表型程度；以绿色荧光和光漂白表型作为筛选依据，在上调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光增强、光漂白表型受到抑制的基因认定为植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子；在下调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光减弱、光漂白表型受到促进的基因认定为抗病毒RNA沉默负调控转录因子，完成筛选。2.如权利要求1所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，其特征在于，步骤1中采用烟草脆裂病毒接种矮牵牛植株具体包括：首先采集保存烟草脆裂病毒的活体植株叶片，研磨后加入磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙道阳，毛雁翔，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：