启动子OsREP4p在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，公开了启动子OsREP4p在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用，所述的启动子为SEQ ID NO.1所示。该启动子受干旱诱导，且特异性的指导外源蛋白在水稻根系中表达，OsREP4p启动子用于水稻抗旱遗传改良有较大的应用前景，该启动子可用于构建抗旱相关基因的表达载体，通过遗传转化方法达到控制目标基因组织特异地受干旱上调表达，从而实现水稻抗旱遗传育种的目的。遗传育种的目的。

【技术实现步骤摘要】
promoters in transgenic rice.Planta.239:47-60,2014.Wei等Ectopic Expression of DREB Transcription Factor,AtDREB1A,Confers Tolerance to Drought in Transgenic Salvia miltiorrhiza.Plant Cell Physiol.57:1593-609,2016；Wei等Modulating AtDREB1C Expression Improves Drought Tolerance in Salvia miltiorrhiza.Front Plant Sci.Jan24；8:52,2017)来进行作物抗性改良的研究均有大量报道，但是一种既具有组织特异性又受逆境诱导的启动子几乎从未有过报道。
[0003]本专利技术鉴定了一个在水稻根系中特异性表达且受逆境诱导上调表达一个未知功能的基因的启动子，通过对该启动子活性分析，可以将该启动子用于抗逆性功能基因在水稻等作物中表达，从而有效地提高植株的抗旱性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供了启动子OsREP4p在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用，本专利技术的启动子启动目的基因特异性的在水稻根系表达，同时受干旱诱导，所述的启动子序列为SEQ ID NO.1所示。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0006]启动子OsREP4p在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用，所述启动子的序列为SEQ ID NO.1所示。
[0007]以上所述的应用中，优选的，其应用过程包括将SEQ ID NO.1所示启动子与目的蛋白连接后连入植物表达载体。
[0008]以上所述的应用中，优选的，应用中的载体用于制备转基因水稻。
[0009]以上所述的应用中，优选的，所述的外源蛋白为抗逆蛋白，甚至是抗干旱蛋白。
[0010]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0011]本专利技术首次公开启动子OsREP4p具备干旱诱导的，水稻根系特异性表达的特点，因此利用该启动子，可将抗旱基因转入水稻中，制备抗旱转基因水稻，具备广阔的应用前景。
附图说明
[0012]图1为实施例1中克隆的OsREP4p启动子序列；
[0013]下划线序列为扩增OsREP4p启动子所用的引物序列，阴影显示的是基本启动子元件序列。根系特异性表达元件用实线框表示，干旱应答元件MBS用波浪线表示。
[0014]图2为OsREP4基因在水稻品种“中花11”,“珍汕97”和“日本晴”的根系中特异性表达示意图；
[0015]其中A为OsREP4基因在水稻品种中花11的根系中特异性表达示意图、B为OsREP4基因在水稻品种珍汕97的根系中特异性表达示意图、C为OsREP4基因在水稻品种日本晴的根系中特异性表达示意图。
[0016]图3为本专利技术构建的DX2181-OsREP4p表达载体；
[0017]该载体含潮霉素抗性筛选基因(HRG)，启动子OsREP4p被融合到GUS基因5
’
端非翻译区。
[0018]图4为OsREP4p启动子驱动GUS报告基因的转基因植株GUS染色情况。
[0019]图5为OsREP4p启动子控制下的GUS基因在正常及20％PEG模拟干旱胁迫处理下的
GUS活性示意图；
[0020]CK是DX2181空载体转化的中花11，作为对照家系，GUS-27是DX2181-OsREP4p转化中花11得到的1个转基因阳性家系，4个时间点分别是胁迫0h、3h、6h、12h。
[0021]图6为OsREP4p启动子控制下的GUS基因在干旱胁迫处理下的GUS活性；
[0022]CK是DX2181空载体转化的中花11，作为对照家系，GUS-27是DX2181-OsREP4p转化中花11得到的1个转基因阳性家系，3个时间点分别是胁迫前D0、叶片微卷D1、叶片全卷D2三个时间点。
具体实施方式
[0023]本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，均来源于商业渠道。
[0024]实施例1：
[0025]OsREP4p启动子分离和鉴定
[0026]通过对水稻成熟期干旱及胁迫条件下根系表型性状的全基因组关联分析，在一个控制正常条件下最大根长的位点范围内，发现了一个具有极强的根系特异性表达(信号值达150000)的基因，其TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)ID为LOC_Os04g11040，被命名OsREP4，其对应的BAC克隆号为AP014960，在KOME数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中对应的全长cDNA编号为AK243272。
[0027]利用引物OsREP4p-F和OsREP4p-R以“日本晴”基因组DNA为模板进行扩增，引物为和反应体系为20uL GC bufferⅠ体系(购自宝生物工程(大连)有限公司，即TaKaRa公司)，反应条件是：95℃预变性5min；95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min 30sec，33个循环；72℃延伸7min。PCR产物纯化之后连入用Hind III酶切过的DX2181载体上。筛选阳性克隆并用DX2181上的测序引物DX2181-SeqF(5
’-
CCAACGCTGATCAATTCCACAG-3
’
)、DX2181-SeqR(5
’-
CTTGCCGTAGGTGGCATCG-3
’
)和一条根据该启动子序列设计的中间测序引物OsREP4p-M(5
’-
TCAAACGTTCGATGTGACAAA-3
’
)来进行测序(测序在擎科生物技术有限公司[武汉]完成)。测序结果分析证实：所扩增序列为预期的OsREP4p启动子序列(SEQ ID NO.1所示)，其包含一个根系特异性表达元件和多个干旱、胁迫诱导应答顺式作用元件(图1)。
[0028]实施例2：
[0029]水稻内源基因OsREP4的组织表达谱
[0030]以水稻品种“中花11”为材料，对幼苗及其田间生长的全生育期各种代表性组织进行取样。总RNA采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取，利用反转录酶MLV(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(5
’-
TGTTGGAAGTGGCACCTCTGT-3
’
和5
’-
CACCCCCATGGTTGCTGTAC-3
’
)对OsREP4基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长71bp)。同时用引物(5
’-
GCCCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SEQ ID NO.1所示核苷酸序列在制备受干旱诱导的水稻根系特异性表达外源蛋白的载体中的应用。2.权利要求1所述的应用中的载体用于制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊立仲，李晓凯，肖本泽，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：