茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因启动子区SSR分子标记引物及应用制造技术

本发明专利技术公开了茶树S

【技术实现步骤摘要】
茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因启动子区SSR分子标记引物及应用


[0001]本专利技术属于分子标记
，尤其茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因启动子区SSR分子标记引物及应用。

技术介绍

[0002]茶树是中国重要的木本经济作物，茶是世界上最古老、最受欢迎的含咖啡碱饮料。茶树中含有咖啡碱(Caffeine)、可可碱(Theobromine)和茶叶碱(Theophylline)等嘌呤类生物碱，同时也含有少量嘧啶类生物碱。生物碱是一类来源于生物界的含氮有机化合物，在植物界分布较广，目前已知至少有50多个科120属以上的植物含有生物碱，已发现和分离出的生物碱近6000种。咖啡碱是茶叶重要的滋味物质，其与茶黄素以氢键缔和后形成的复合物具有鲜爽味，因此茶叶咖啡碱含量也常被看做是影响茶叶质量的一个重要因素。此外，咖啡碱对人体具有一定的兴奋作用，因此还具有一定的药理功能。
[0003]S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)(E.C.2.5.1.6)催化甲硫氨酸和ATP反应生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM既是植物体内转甲基反应的甲基供体及多胺和乙烯合成的前体，同时也是茶树咖啡碱生物合成过程中甲基化反应的唯一甲基供体。SAM及SAM合成酶基因在茶树中可以参与咖啡因生物合成，并能对逆境中的茶树起保护作用。SAMS是一种胞内酶，除了肺囊虫与沙眼衣原体等之外，它广泛存在于动物、植物及微生物体内，至今已经分别从原核生物细菌和真核生物酵母、拟南芥、烟草、蝴蝶兰、白木香、马铃薯、棉花等克隆到了SAMS基因。2005年，浙江大学的梁月荣等克隆了茶树的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，序列长1303bp，编码394个氨基酸，该基因与中华猕猴桃、番茄、长春花的SAM合成酶基因的核苷酸序列同源性分别为87％，83％和83％；其氨基酸序列(登录号为AB041534)与三角杨、猕猴桃、番茄、长春花等的SAM氨基酸序列同源性为92％～90％。
[0004]SAM是茶树咖啡碱生物合成过程中甲基化反应的唯一甲基供体，因此S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因是咖啡碱合成重要关键酶，但是针对S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因SSR分子标记引物开发及应用研究还未见报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因启动子区SSR分子标记引物及应用，以便于进一步研究茶树生物碱合成以及茶树遗传多态性。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SSR分子标记，分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列，标记编号为SSR1-SAMS、SSR2-SAMS。
[0008]扩增上述茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SSR分子标记的引物，分子标记SSR1-SAMS、SSR2-SAMS的引物分别包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。
[0009]上述SSR分子标记的制备方法，利用特定引物对茶树总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；引物包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。
[0010]上述SSR分子标记的制备方法，包括以下操作步骤：
[0011]<1>提取DNA
[0012]采用试剂盒提取茶树的基因组DNA作为模板；
[0013]<2>PCR反应
[0014]反应体系：反应总体积为20μL，其中2
×
PCR Mix 10μL，茶树DNA模板1μL，ddH2O 8μL，正向引物和反向引物各1μL；
[0015]反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存；
[0016]<3>电泳显色
[0017]取5μL PCR产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min；电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。
[0018]正向引物为序列表SEQ.ID.No.3、SEQ.ID.No.5的引物，反向引物为序列表SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.6的引物。
[0019]茶树DNA模板为1～50ng，正向引物或反向引物的浓度为10μmol/L。
[0020]上述SSR分子标记在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
[0021]上述SSR分子标记在茶树生物碱的生物合成研究方面的应用。
[0022]上述SSR分子标记的引物在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
[0023]上述SSR分子标记的引物在茶树生物碱的生物合成研究方面的应用。
[0024]针对目前茶树的生物碱合成途径关键酶研究尚少的问题，专利技术人在
‘
云抗10号
’
大叶茶树全基因组公开报道的基础上，利用分子标记技术研究开发了茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SSR分子标记(SSR1-SAMS、SSR2-SAMS)引物及其应用。研究表明，本专利技术依据具体特定的基因，在茶树全基因组上开发其SSR引物方法可行，所得引物多态性高、重复性好，具有较好的可行性、针对性。据此，专利技术人开展了茶树种质资源遗传多态性的研究。综上，本专利技术的研究方法、SSR分子标记及其引物，可广泛应用于茶树品种鉴定、遗传结构和资源多样性分析、遗传图谱构建，功能基因定位及QTL定位、种子纯度鉴定、分子标记辅助选育种研究中，便于进一步研究茶树生物碱合成以及茶树遗传多态性，促进深入开发茶树资源。
附图说明
[0025]图1是茶树SSR1-SAMS和SSR2-SAMS引物扩增片段的聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：M：2000bp DNA Marker；各泳道对应茶种质材料分别为：1，7是德保茶；2，8是黄金茶；3，9是紫鹃；4，10是湘波绿；5，11是金牡丹；6，12是罗香2号。各泳道对应引物扩增片段为：泳道1-6为SSR1-SAMS引物扩增片段；泳道7-12为SSR2-SAMS引物扩增片段。
[0026]图2是位于SAMS基因间区(intergenic)的其它SSR-SAMS引物扩增片段的聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：各泳道对应茶种质材料分别为：1，7，13，19，25，31是德保茶；2，8，14，20，
26，32是黄金茶；3，9，15，21，27，33是紫鹃；4，10，16，22，28，34是湘波绿；5，11，17，23，29，35是金牡丹；6，12，18，24，30，36是罗香2号。各泳道对应引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SSR分子标记，其特征在于分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列，标记编号为SSR1-SAMS、SSR2-SAMS。2.扩增权利要求1所述茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SSR分子标记的引物，其特征在于分子标记SSR1-SAMS、SSR2-SAMS的引物分别包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。3.权利要求1所述SSR分子标记的制备方法，其特征在于：利用特定引物对茶树总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；所述引物包括具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5和SEQ.ID.No.6的碱基序列。4.根据权利要求3所述的SSR分子标记的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：<1>提取DNA采用试剂盒提取茶树的基因组DNA作为模板；<2>PCR反应反应体系：反应总体积为20μL，其中2
×
PCR Mix 10μL，茶树DNA模板1μL，ddH2O 8μL，正向引物和反向引物各1μL；反应程序：94℃预变性5min，接着每...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书四页序列表二页附图二页，
申请(专利权)人：广西壮族自治区亚热带作物研究所广西亚热带农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：