一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母、其构建方法、用于产豆甾醇的发酵培养基及应用技术

本发明专利技术涉及一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母构建方法及其应用。本发明专利技术通过插入24

【技术实现步骤摘要】
一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母、其构建方法、用于产豆甾醇的发酵培养基及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
更具体地，本专利技术涉及一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母及其构建方法，还涉及用于产豆甾醇的发酵培养基，及其在生产豆甾醇中的应用。

技术介绍

[0002]豆甾醇是广泛分布于植物界的甾醇，是一种具有生理价值的物质，它在医药、化妆品、动植物生长及及纸张加工、印刷、食品领域有着广泛的用途。但是豆甾醇与其它植物甾醇结构与性质相似，难以分离。传统豆甾醇的提取多采用植物提取的方式，无论是化学法还是物理法都面临操作工程繁琐、收率低、溶剂安全隐患、排放污染严重以及工业化程度低等缺点，因此豆甾醇单品不仅市场供应不足并且价格较高。
[0003]微生物合成是一种成本低、产量高、污染小并且产品纯度高生产方法，广泛应用在生物提取行业。目前针对植物甾醇的生物合成主要以改造酵母菌株为主，这是由于菜油甾醇与微生物来源的主要甾醇(麦角甾醇)的区别在于C7
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8和C22
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23位是饱和单键，中国专利技术专利申请CN 113604470 A公开了苟元元等人以解脂亚罗酵母为宿主，敲除了C
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22去饱和酶编码基因ERG5以此截断了麦角固醇合成路径，表达了来自斑马鱼的7
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脱氢胆固醇还原酶编码的基因DHCR7并且表达强启动子TEF30，获得高产菜油甾醇。
[0004]菜油甾醇和谷甾醇的合成路径区别在于，在合成24
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亚甲基苯酚后没有甲基转移酶合成24
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亚乙基苯酚，而谷甾醇与豆甾醇的区别在于C22
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23是饱和单键。如果在甾醇合成通路上添加24
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亚甲基甾醇C
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甲基转移酶以及C22
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去饱和酶，可以将菜油甾醇转化为豆甾醇。目前还没有直接合成的豆甾醇工程菌，可能是由于以下几个方面原因：
①
豆甾醇合成通路上的24
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亚甲基甾醇C
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甲基转移酶基因以及C22
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去饱和酶基因存在于植物、藻类或藓类上，野生型菌株中不存在；
②
细胞膜上脂质双层酰基链的堆积密度受甾醇组成的影响，豆甾醇增强膜秩序的能力小于菜油甾醇和谷甾醇，高含量的豆甾醇可能会导致胞内的氧化还原调节、激素转运和信号传导受到影响；
③
豆甾醇在对不利温度的耐受中发挥作用，目前的生物发酵更追求微生物在适宜的环境下生长，没有对温度胁迫的发掘；
④
专利技术人认为目前针对生产豆甾醇的生物改造通常目标为通路上基因的表达，对于物质合成的能量供给关注较少，导致能量无法供给合成豆甾醇的相关物质，不能达到生物合成的要求。
[0005]本专利技术针对目前缺少直接生物合成的豆甾醇工程菌，工程菌培养时豆甾醇组成的膜秩序能力不强，缺乏增加豆甾醇含量的工程菌培养方法以及没有发现增强酶的基因等问题，专利技术了一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母构建方法及其应用。通过大量实验研究与分析总结，终于完成了本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母，并提供其构建方法。
[0007]本专利技术的另一个目的是通过所述重组解脂亚罗酵母实现高产豆甾醇，并提供其培养方法及培养基。
[0008]本专利技术的思路是采用24
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亚甲基甾醇C
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甲基转移酶基因SMT2和C22
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去饱和酶基因CYP710A11这两个合成豆甾醇通路上的必须基因，尝试对插入了这两个基因的重组工程菌株作进一步改进，使酵母能高产豆甾醇。
[0009]基于此，本专利技术提供一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母，所述重组解脂亚罗酵母是通过插入24
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亚甲基甾醇C
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甲基转移酶基因SMT2和C22
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去饱和酶基因CYP710A11，并过表达基因Arh1得到的重组解脂亚罗酵母工程菌。
[0010]在本专利技术中，所述24
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亚甲基甾醇C
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甲基转移酶基因SMT2来自小立碗藓、序列如SEQ ID NO.1所示；所述C
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22去饱和酶基因CYP710A11来自番茄序列如SEQ ID NO.2所示、来自烟草序列如SEQ ID NO.3所示、或来自小立碗藓序列如SEQ ID NO.4所示；所述的Arh1基因来自解脂亚罗酵母，其序列SEQ ID NO.5所示。
[0011]本专利技术还提供上述重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0012](1)构建含有24
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亚甲基甾醇C
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甲基转移酶基因SMT2的工程菌
[0013]合成经密码子优化后的小立碗藓24
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亚甲基甾醇C
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甲基转移酶基因PpSMT2，以NdeI/SpeI为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述基因PpSMT2，连接获得重组质粒ploxpura3loxp
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PpSMT2，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母菌株中，获得重组解脂亚罗酵母菌株YL
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PpSMT2，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；
[0014](2)构建含有C
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22去饱和酶基因的工程菌
[0015]分别合成经密码子优化后的来自番茄、烟草和小立碗藓的C
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22去饱和酶基因序列SlCYP710A11、NaCYP710A11和PpCYP710A1，经密码子优化后分别以NdeI/SpeI为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述C
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22去饱和酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp
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SlCYP710A11、ploxpura3loxp
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NaCYP710A11和ploxpura3loxp
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PpCYP710A1，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法分别转入步骤(1)得到的YL
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SMT2中，获得的重组菌株分别记为YL
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PpSMT2
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SlCYP710A11、YL
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PpSMT2
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NaCYP710A11和YL
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PpSMT2
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PpCYP710A1，所得重组菌株经通过菌落PCR验证正确；
[0016](3)工程菌的Arh1基因的过表达
[0017]获取解脂亚罗酵母的全基因组后，得到目的基因Arh1，将基因Arh1连接到载体pJN44的多酶切位点上，得到质粒pJN44
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Arh1；所得质粒通过酶切验证后分别转入步骤(2)的重组菌株YL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产豆甾醇的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述重组解脂亚罗酵母是通过插入24
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亚甲基甾醇C
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甲基转移酶基因SMT2和C22
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去饱和酶基因CYP710A11，并过表达基因Arh1得到的重组解脂亚罗酵母工程菌。2.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述24
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亚甲基甾醇C
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甲基转移酶基因SMT2来自小立碗藓、序列如SEQ ID NO.1所示；所述C
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22去饱和酶基因CYP710A11来自番茄序列如SEQ ID NO.2所示、来自烟草序列如SEQ ID NO.3所示、或来自小立碗藓序列如SEQ ID NO.4所示；所述的Arh1基因来自解脂亚罗酵母，其序列SEQ ID NO.5所示。3.权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建含有24
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亚甲基甾醇C
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甲基转移酶基因SMT2的工程菌合成经密码子优化后的小立碗藓24
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亚甲基甾醇C
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甲基转移酶基因PpSMT2，以NdeI/SpeI为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述基因PpSMT2，连接获得重组质粒ploxpura3loxp
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PpSMT2，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母菌株中，获得重组解脂亚罗酵母菌株YL
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PpSMT2，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；(2)构建含有C
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22去饱和酶基因的工程菌分别合成经密码子优化后的来自番茄、烟草和小立碗藓的C
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22去饱和酶基因序列SlCYP710A11、NaCYP710A11和PpCYP710A1，经密码子优化后分别以NdeI/SpeI为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述C
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22去饱和酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp
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SlCYP710A11、ploxpura3loxp
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NaCYP710A11和ploxpura3loxp
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PpCYP710A1，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法分别转入步骤(1)得到的YL
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SMT2中，获得的重组菌株分别记为YL
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PpSMT2
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SlCYP710A11、YL
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PpSMT2
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NaCYP71...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云博，杨璐，郭建琦，牛永洁，孟永宏，张佳，
申请(专利权)人：陕西海斯夫生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：