一种细胞穿透肽-甾醇耦合物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞穿透肽

【技术实现步骤摘要】
一种细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物及其制备方法。

技术介绍

[0002]细胞穿透肽是一类对带正电荷，对细胞膜具有强力穿透作用的短肽，可用来修饰脂质体、纳米粒、胶束等纳米药物递送系统，促进细胞摄取，目前在药物递送领域受到了广泛关注。以脂质体为例，细胞膜表面带有负电荷，普通脂质体的入胞能力有限，经细胞穿透肽修饰的脂质体表面带有正电荷，与细胞膜产生静电吸附作用，可显著提高脂质体的入胞效率。
[0003]一种细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物是指经细胞穿透肽修饰的甾醇，甾醇包括胆固醇、麦角固醇、β
‑
谷甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇等。胆固醇是哺乳动物细胞膜的主要组成部分，能与磷脂产生相互作用，调节脂膜结构、动力学特性等，化学结构如图1。同时，胆固醇在人体内具有重要生理作用，是胆汁酸和类固醇激素合成的前体。胆固醇可作为脂质体膜材、乳化剂、软膏基质等药用辅料，尤其在脂质体制剂中对提高制剂稳定性有重要作用。在制备脂质体时添加适量的胆固醇，可使膜保持流动性的同时具备一定刚性。麦角固醇是真菌细胞膜中的主要甾醇成分，可以通过微生物发酵合成得到，与胆固醇结构相似，化学结构如图2。麦角固醇具有抑菌、抗肿瘤、抗炎等作用，且为黄体酮、可的松、维生素D2等多种药物的前体，对膜结构有重要作用，可增加膜的堆积，起到填充双层膜的作用。β
‑
谷甾醇(化学结构如图3)、豆甾醇(化学结构如图4)为植物甾醇，被称为健康型甾醇，与胆固醇结构类似，却能够抑制胆固醇在肠道的吸收并影响其代谢，对心血管代谢性疾病和癌症等也有预防作用，β
‑
谷甾醇、豆甾醇剂量适当具有与胆固醇类似的热致相行为和抗脂质体氧化的作用；天然的植物甾醇属于无毒物，是一类被允许在食品中添加的甾醇，在脂质体制剂中使用安全可靠，植物甾醇具有与胆固醇相似的调节脂膜的能力，所得功能性脂质体能保持与原胆固醇脂质体类似的基本特征；且植物甾醇赋予了脂质体自身干扰体内胆固醇吸收和抗肿瘤等药理活性；这类健康型甾醇的药理作用以及不使用胆固醇，扩大了脂质体制剂在降血脂领域的应用。羊毛甾醇(化学结构如图5)是菌类甾醇，广泛用于食品、医药、化工行业中的安全性天然产物，具备生产原料成本低、易工业化生产等优势。一定浓度范围下如20％的用量的羊毛甾醇具有脂膜调节作用。菌类甾醇丰富的药理活性以及细微的结构差异赋予脂质体新的特性。
[0004]经检索，凯瑟琳
·
菲奥纳
·
多尔顿等(专利，公开号：CN104530190A)采用Fmoc和Boc固相肽方法合成肽链，使用哌啶脱除Fmoc保护基，其次缩合剂为二异丙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺以及N
‑
乙基
‑
N
’‑
(3
‑
二甲基
‑
氨基丙基)碳二亚胺，与本专利技术明显不同，本专利技术采用的是吗啉脱除Fmoc保护基，其次缩合剂采用的是苯并三氮唑
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯以及1
‑
羟基苯并三氮唑；拉尔夫
·
艾森胡特等(专利，公开号：CN111670194A)采用Fmoc固相肽法合成胰高血糖素肽，缩合剂采用的是TBTU，与本专利技术明显不同，首先目标肽链不同，本专利技术目标肽链为自主设计，其次本专利技术缩合剂采用的是HBTU。
[0005]本专利技术的创新点在于：第一，细胞穿透肽肽链为自主设计并合成；第二，利用溴乙
酸/吡啶酸与甾醇形成中间体化合物，继而与多肽链连接，合成路线为自主设计；第三，除胆固醇外，其他甾醇几乎未应用于纳米递送载体的构建。

技术实现思路

[0006]本专利技术涉及一种细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物及其制备方法具有以下优点：第一，自主设计细胞穿透肽CGYKK(图6)、CGYRR(图7)、CGYYK(图8)，采用Fmoc固相合成法合成，收率高，合成速度快；第二，利用溴乙酸/吡啶酸与甾醇形成中间体化合物，继而与多肽链连接，制备细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物经分离纯化后，纯度高，杂质少；第三，将本专利技术所得细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物应用纳米载体构建中，一方面发挥甾醇的成膜性，一方面发挥细胞穿透肽的正电性，提高载体进入细胞的转染效率；第四，除胆固醇外，其他甾醇几乎未应用于纳米递送载体的构建，但各自具有不同生物活性，故可根据纳米载体用途选用相应甾醇的耦合物作为脂质材料；第五，细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物在完成转染后，在细胞内可被酯酶代谢分解，成为相应的甾醇和氨基酸，均为细胞生长可利用的原材料，生物毒性低，而一般的季铵盐正电荷磷脂材料与体内细胞膜中的中性磷脂结构差异较大，在细胞内缺少高效的代谢途径，故而生物毒性较高，细胞损伤较大。
[0007]一种细胞胞穿透肽
‑
甾醇耦合物的制备方法，包括下述步骤：
[0008]步骤1，采用树脂与氨基酸进行偶联反应，使树脂上偶联有直链肽；
[0009]步骤2，向树脂中加入切割液反应，经过滤处理后，加入二甲基甲酰胺(DMF)或异丙醇洗掉多余的液体；
[0010]步骤3，加入缩合剂以及氨基酸，进行连接；
[0011]步骤4，重复步骤2、3的操作，连接上最后一个氨基酸；
[0012]步骤5，加入切割液，切掉所有的保护基团，即可获得目标细胞穿透肽；
[0013]步骤6，将溴乙酸或吡啶酸、EDCI、DMAP、甾醇，溶于二氯甲烷中，冰浴下搅拌，然后继续在室温下反应，依次用饱和NaHCO3和饱和NaCl水溶液洗涤，无水MgSO4或Na2SO4干燥，得中间体化合物B。
[0014]步骤7，中间体化合物B经柱层析纯化，得甾醇溴乙酸酯或甾醇吡啶酸酯；
[0015]步骤8，将细胞穿透肽、甾醇、溴乙酸酯或吡啶酸酯溶于DMF，室温下反应h，经萃取浓缩可得细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物。
[0016]具体地，CGYKK的氨基酸加入顺序为赖氨酸、赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸和半胱氨酸；CGYRR的氨基酸加入顺序为精氨酸、精氨酸、酪氨酸、甘氨酸和半胱氨酸；CGYYK的氨基酸加入顺序为赖氨酸、酪氨酸、酪氨酸、甘氨酸和半胱氨酸；所述甾醇包括胆固醇、麦角固醇、β
‑
谷甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇。
[0017]具体地，一种细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物及其制备方法，甾醇包括胆固醇、麦角固醇、β
‑
谷甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇，
[0018]包括下述步骤：
[0019]步骤1，采用树脂与氨基酸进行偶联反应，使树脂上偶联有直链肽；
[0020]步骤2，向树脂中加入切割液反应，经过滤处理后，加入二甲基甲酰胺(DMF)/异丙醇洗掉多余的液体；
[0021]步骤3，加入缩合剂以及氨基酸，进行连接；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物的制备方法，其特征在于：由肽链和甾醇通过化学反应连接，所述肽链采用Fmoc固相合成法合成的五肽。2.如权利要求1所述的细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物的制备方法，其特征在于：所述细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物带正电荷。3.如权利要求1所述的细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物的制备方法，其特征在于，所述细胞穿透肽C端为精氨酸或者赖氨酸，同时提供正电荷。4.如权利要求1所述的细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物的制备方法，其特征在于，利用溴乙酸或吡啶酸与甾醇形成中间体化合物，继而与多肽链连接。5.如权利要求1所述的细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物，其特征在于：所述甾醇为胆固醇或麦角固醇或β
‑
谷甾醇或豆甾醇或羊毛甾醇。6.一种细胞穿透肽
‑
甾醇耦合物，其特征在于：所述细...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明媛，李世勤，李媛，贾琳，苏雯，户博蕊，马文林，孔祥舜，谢焱博，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：