利用CRISPR/dCas9敲低调控蛋白表达以提高TG酶产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/dCas9敲低调控蛋白表达以提高TG酶产量的方法；是通过CRISPR/dCas9技术同时敲低茂源链霉菌C2基因组中调控蛋白编码基因SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720，得到TG酶产量提高的突变株。同时敲低4个调控蛋白编码基因降低了它们对TG酶的负调控，由此来提高TG酶产量。本发明专利技术所得的工程菌株的TG酶发酵终产量较转入空载体的对照菌株提高了74.3％。通过本发明专利技术可显著提高TG酶的发酵产量，同时使发酵成本大幅降低。低。低。

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/dCas9敲低调控蛋白表达以提高TG酶产量的方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，涉及一种利用CRISPR/dCas9敲低调控蛋白表达以提高TG酶产量的方法；尤其涉及一种利用CRISPR/dCas9技术组合敲低调控蛋白SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720编码基因以提高谷氨酰胺转氨酶(TG酶)发酵水平的方法。

技术介绍

[0002]谷氨酰胺转氨酶(TG酶)是由茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ
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酰胺基和赖氨酸的ε
‑
氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε
‑
(γ
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谷酰胺)
‑
赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质。TG酶是外分泌蛋白，在胞内为pre
‑
pro
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MTGase初始形式，穿过细胞膜成为无活性的酶原pro
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TGase，经过金属蛋白酶TAMEP切割信号肽成为FRAP
‑
TGase，再经丝氨酸蛋白酶SM
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TAP切割成为最终成熟的TG酶。 TG酶作为一种蛋白交联剂，因其稳定性好、使用安全等优点而被广泛应用，在食品领域通过交联谷氨酰胺残基和赖氨酸残基能够将小块肉类结合成大块，提高食品的美观度，通过整合氨基酸增加营养，生物合成TG酶制作可降解塑料包装；在医药领域可用来交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物，催化明胶和胶原蛋白形成支架植入人体使器官再生等等。TG酶的调控途径并不清楚，是工业上限制 TG酶产量提高的关键因素。本专利技术中，通过基因组学信息和过表达、敲低实验结果，找到了TG酶的负调控蛋白SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和 SMDS_720编码基因SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720。同时敲低4个负调控蛋白编码基因可以降低对TG酶合成的负调控，最终可明显提高TG酶产量。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种利用CRISPR/dCas9敲低调控蛋白表达以提高 TG酶产量的方法；通过同时敲低茂源链霉菌C2基因组中调控蛋白编码基因 SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720，可以降低对TG酶合成的负调控，最终可明显提高TG酶产量。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0005]本专利技术涉及一种敲低调控蛋白表达以提高TG酶产量的方法，(利用 CRISPR/dCas9技术)同时敲低茂源链霉菌C2基因组中调控蛋白SMDS_4150、 SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的编码基因SMDS_4150、SMDS_1792、 SMDS_3072和SMDS_720，以提高TG酶发酵水平。是通过同时敲低茂源链霉菌 C2基因组中调控蛋白SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720编码基因SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720，降低了对TG酶合成的负调控，最终可明显提高TG酶产量。
[0006]作为一个实施方案，所述调控蛋白编码基因SMDS_4150、SMDS_1792、 SMDS_3072和SMDS_720的序列依次如SEQ ID NO.1
‑
4所示。
[0007]作为一个实施方案，所述方法包括如下步骤：
[0008]S1、构建用于同时敲低SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的CRISPR/dCas9质粒载体I；
[0009]S2、将构建得到的CRISPR/dCas9质粒载体I通过接合转移导入受体菌茂源链霉菌C2中进行特异性抑制；
[0010]S3、通过安普霉素抗性和PCR验证筛选，得到SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720敲低的突变株。
[0011]作为一个实施方案，质粒载体I的构建包括如下步骤：
[0012]A1、设计靶向抑制SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的sgRNA的20nt序列，通过PCR扩增分别得到含有目标20nt的sgRNA片段，通过Gibsonassembly与SpeI/EcoRI双酶切后的整合型质粒pSET
‑
dCas9进行组装，得到4个分别抑制4个基因的质粒；
[0013]A2、设计通用质粒pGGA载体和4个sgRNA片段的4nt突出末端及引物，PCR扩增分别得到4个片段，将4个sgRNA片段和载体组装到一起；通过PCR将4个sgRNA片段一起扩增下来，通过Gibsonassembly与EcoRI/EcoRV双酶切后的pSET
‑
dCas9进行组装，得到同时抑制4个基因的质粒载体I。
[0014]作为一个实施方案，步骤A1中，抑制SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的sgRNA的20nt序列依次如SEQIDNO.5
‑
8所示。
[0015]作为一个实施方案，步骤A1中，PCR扩增的引物包括：序列如SEQIDNO.9/10所示的4150
‑
gRNA
‑
F/dCas9
‑
gRNA
‑
R、序列如SEQIDNO.11/10所示的1792
‑
gRNA
‑
F/dCas9
‑
gRNA
‑
R、序列如SEQIDNO.12/10所示的3072
‑
gRNA
‑
F/dCas9
‑
gRNA
‑
R、序列如SEQIDNO.13/10所示的720
‑
gRNA
‑
F/dCas9
‑
gRNA
‑
R。
[0016]作为一个实施方案，骤A2中，所述引物包括序列如SEQIDNO.14/15所示的part1
‑
F/R、序列如SEQIDNO.16/17所示的part2
‑
F/R、序列如SEQIDNO.18/19所示的part3
‑
F/R、序列如SEQIDNO.20/21所示的part4
‑
F/R。
[0017]作为一个实施方案，步骤A2中，将4个sgRNA片段一起扩增下来采用的是序列如SEQIDNO.24/25所示的引物GGA
‑
Gibson
‑
F/R。
[0018]作为一个实施方案，步骤A2中，将4个sgRNA片段和载体组装到一起形成质粒，利用序列如SEQIDNO.22/23所示的引物pGGA...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种敲低调控蛋白表达以提高TG酶产量的方法，其特征在于，同时敲低茂源链霉菌C2基因组中调控蛋白编码基因SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调控蛋白编码基因SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的序列依次如SEQ ID NO.1、NO.2、NO.3、NO.4所示。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、构建用于同时敲低SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的CRISPR/dCas9质粒载体I；S2、将构建得到的CRISPR/dCas9质粒载体I通过接合转移导入受体菌茂源链霉菌C2中进行特异性抑制；S3、通过安普霉素抗性和PCR验证筛选，得到SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720敲低的突变株。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，质粒载体I的构建包括如下步骤：A1、设计靶向抑制SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的sgRNA的20nt序列，通过PCR扩增分别得到含有目标20nt的sgRNA片段，通过Gibson assembly与SpeI/EcoRI双酶切后的整合型质粒pSET
‑
dCas9进行组装，得到4个分别抑制4个基因的质粒；A2、设计通用质粒pGGA载体和4个sgRNA片段的4nt突出末端及引物，PCR扩增分别得到4个片段，将4个sgRNA片段和载体组装到一起；通过PCR将4个sgRNA片段一起扩增下来，通过Gibson assembly与EcoRI/EcoRV双酶切后的pSET
‑
dCas9进行组装，得到同时抑制4个基因的质粒载体I。5.权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A1中，抑制SMDS_4150、SMDS_1792、SMDS_3072和SMDS_720的sgRNA的20nt序列依次如SEQ ID NO.5
‑
8所示。6.权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A1中，PCR扩增的引物包括：序列如SEQ ID NO.9/10所示的4150
‑
gRNA
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F...

【专利技术属性】
技术研发人员：白林泉，刘先，步建国，
申请(专利权)人：泰兴市东圣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：