一种透明质酸裂解酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种透明质酸裂解酶及其应用。本发明专利技术提供了一种透明质酸裂解酶Hya16A，并利用该特异性的透明质酸裂解酶，将透明质酸特异性地降解为不饱和二糖，通过测定232nm处的吸光值测定透明质酸的含量，实现了透明质酸的酶法快速定量检测，具有灵敏度高、准确性好、操作简便等优点。优点。优点。

【技术实现步骤摘要】
一种透明质酸裂解酶及其应用


[0001]本专利技术涉及生物技术及生化检测
，尤其涉及一种透明质酸裂解酶及其应用。

技术介绍

[0002]透明质酸(Hyaluronan或Hyaluronic acid，HA)，是一种天然存在于生物体内的糖胺聚糖(Glycosaminoglycans，GAG)。透明质酸是由D
‑
葡萄糖醛酸和N
‑
乙酰
‑
D
‑
葡萄糖胺以β
‑
1，3糖苷键相连构成二糖单元，该二糖单元再以β
‑
1，4糖苷键连接形成的多糖，分子式为：(C
14
H
21
NO
11
)
n
。透明质酸广泛存在于结缔组织如关节、玻璃体、滑液、脐带、软骨、皮肤、鸡冠以及A族和C族溶血性链球菌中。在机体中有提高韧性、增强结构支持、参与细胞代谢等功能。透明质酸一般是无色无味无定型状的固体，易溶于水，不溶于有机溶剂。由于透明质酸分子在空间结构上呈刚性螺旋柱形，柱内侧的羟基具有高度亲水性，同时，羟基的连续、定向排列，在透明质酸分子链上形成高度憎水区，即使在浓度很低时，透明质酸也可形成三维网状结构，所以透明质酸有很强的吸湿性、保水性和粘弹性，是良好的天然保湿因子，常用做化妆品成分以及作为新食品原料添加至食品中。
[0003]透明质酸的定量检测是透明质酸质量控制、功能研究、产品开发中的基础环节。目前透明质酸常用的检测方法有咔唑显色法、HPLC法和CTAB比浊法等。咔唑法需要强酸和高温条件，且重现性差、操作繁琐。HPLC法通过对样品进行水解、衍生及预处理，通过测定透明质酸组成单糖的含量合计得到透明质酸含量，该方法灵敏度高、准确性好，但仪器成本高、检测周期长。所以急需一种检测流程快速简便的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是常用的透明质酸定量检测方法是咔唑法和HPLC法，这两种方法分别具有重现性差和操作繁琐、费时费力的问题，急需一种检测流程快速简便的方法。
[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种透明质酸裂解酶Hya16A，利用该特异性的透明质酸裂解酶，将透明质酸特异性地降解为不饱和二糖，通过测定232nm处的吸光值测定透明质酸的含量，实现了透明质酸的酶法快速定量检测，具有灵敏度高、准确性好、操作简便等优点。
[0006]为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种透明质酸裂解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
[0007]SEQ ID NO.1
[0008]MSVSRRLFLGGFTAGAVTVAAGAAATPAAAAEADGPTTTFDGPVVAEGFRTDSTVKSAFFKTTSTTEHAVTAYQAGTSGSGVALNVVSKNPGDSAMYLSGTEKAHGTLKISHTGHADGSDEKASALSIDLLTAGTAAQGIFVKAGNGPTTGNLICLRNNARDDFVVKGSGRVGIGMGVGGNPWSQLHVVQQPGTDSALMVEGTVRVVDVASAPTGVDSRGGGVLYAENGALKWRGSDNTVTTIAPA
[0009]透明质酸裂解酶来源于病原真菌、细菌和噬菌体等微生物。本专利技术的透明质酸裂解酶，命名为Hya16A，具有新颖的氨基酸序列及良好的酶学性质，通过β
‑
消除机制特异性地将透明质酸降解为不饱和二糖，以2
‑
氨基乙酰
‑2‑
脱氧
‑3‑
O
‑
(β
‑
D
‑
葡萄糖
‑4‑
烯吡喃糖醛酸
‑
)D
‑
葡萄糖为主要产物，在产物非还原端的糖单元的C4‑
C5位间形成不饱和双键，该双键在232nm紫外光下具有最大吸收值，因此用紫外分光光度计检测透明质酸裂解酶与底物反应后不饱和双键含量的变化即可测定透明质酸含量。
[0010]进一步的，所述透明质酸裂解酶的最适反应温度为45℃，在30
‑
50℃的范围内能保持80％以上的酶活。其最适反应pH值为8.0，在pH7.0
‑
9.0的pH范围内基本保持稳定。该酶具有良好的贮存稳定性，在4℃下可至少稳定贮存3个月，酶动力学常数Km为0.03mg/mL，Kcat为13.41s
‑1，Km/Kcat为4.25μM
‑1s
‑1。
[0011]该酶具有良好的反应特异性，对于透明质酸具有高活力，对于其它糖胺聚糖，如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素等均无降解作用。综上，透明质酸裂解酶Hya16A在定量检测透明质酸方面有良好的应用潜力，具有操作简便、准确度高、稳定性好的特点，且检测周期短，可以在20分钟内完成检测，实现透明质酸的特异性快速定量。
[0012]一种编码上述透明质酸裂解酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2或可翻译出SEQ ID NO.1的所有基因。
[0013]SEQ ID NO.2
[0014]ATGAGCGTGTCGCGGAGGTTGTTCCTCGGAGGGTTCACCGCGGGGGCGGTGACCGTGGCGGCGGGCGCCGCCGCGACGCCGGCGGCGGCCGCGGAGGCGGACGGCCCGACGACGACGTTCGACGGTCCGGTGGTGGCGGAGGGTTTCAGGACGGACTCCACCGTCAAGTCCGCCTTCTTCAAGACGACGTCGACGACCGAGCACGCGGTGACGGCCTATCAGGCCGGCACGTCCGGCAGCGGCGTGGCCCTGAACGTCGTATCGAAGAACCCGGGTGACTCGGCCATGTATCTCAGTGGCACGGAGAAGGCGCACGGCACGCTGAAGATCTCGCACACGGGCCACGCGGACGGCTCGGACGAGAAGGCGTCCGCTCTGTCGATCGACCTGCTGACGGCGGGGACGGCAGCCCAGGGCATCTTCGTGAAGGCGGGCAACGGGCCCACCACCGGCAACCTGATCTGCCTGCGCAACAACGCCCGAGACGACTTCGTCGTCAAGGGCAGCGGGCGGGTCGGTATCGGCATGGGCGTGGGCGGCAACCCCTGGTCGCAGCTCCATGTCGTGCAGCAGCCGGGCACCGACTCGGCGCTGATGGTCGAGGGCACGGTGCGGGTCGTCGACGTGGCCTCCGCGCCCACGGGCGTCGACTCGCGCGGCGGCGGCGTGCTGTACGCGGAGAACGGTGCGCTGAAGTGGCGCGGCTCCGACAACACGGTCACCACCATCGCCCCCGCCTGA
[0015]上述透明质酸裂解酶Hya16A在透明质酸快速定量检测中的应用。
[0016]一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种透明质酸裂解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。2.如权利要求1所述的透明质酸裂解酶，其特征在于：所述透明质酸裂解酶的反应温度为30
‑
50℃，最适反应温度为45℃；其反应pH为7.0
‑
9.0，最适反应pH值为8.0；该酶在4℃下可至少稳定贮存3个月，酶动力学常数Km为0.03mg/mL，Kcat为13.41s
‑1，Km/Kcat为4.25μM
‑1s
‑1。3.一种编码上述透明质酸裂解酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2或可翻译出SEQ ID NO.1的所有基因。4.权利要求1中的透明质酸裂解酶在透明质酸快速定量检测中的应用。5.一种酶法快速定量检测透明质酸的方法，其特征在于：利用权利要求1所述透明质酸裂解酶特异性地将透明质酸降解为不饱和二糖；将酶灭活离心后测定上清液在232nm处的吸光值，对比标准曲线得到透明质酸的含量。6.如权利要求5所述的酶法快速定量检测透明质酸的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)透明质酸溶液的配制：称取化学纯或以上纯度的透明质酸溶于缓冲液中，制备具有浓度梯度的透明质酸标准溶液；(2)定量标准曲线的绘制：取步骤(1)配制的不同浓度透明质酸溶液分别与适量的透明质酸裂解酶液混合进行反...

【专利技术属性】
技术研发人员：常耀光，孙孟辉，薛长湖，李嘉靖，陈广宁，张玉莹，薛勇，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：