一种增强同源重组能力的酵母基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种增强同源重组能力的酵母基因工程菌及其应用，涉及生物工程领域。所述酵母基因工程菌，以酵母作为出发菌株，通过导入基因构建获得所述酵母基因工程菌，导入基因包括以下任意一组：(1)RAD52基因、RAD59基因和MRE11基因；(2)RAD52基因和RAD59基因；(3)RAD52基因和MRE11基因；(4)RAD52基因和SAE2基因；(5)RAD52基因；(6)RAD52基因、RAD59基因、MRE11基因和SAE2基因。本发明专利技术的酵母基因工程菌能够实现具有约40bp同源臂的异源基因表达盒的单、二和三基因同时整合，效率分别高达100％、约98％和约81％。约98％和约81％。约98％和约81％。

【技术实现步骤摘要】
一种增强同源重组能力的酵母基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种增强同源重组能力的酵母基因工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]毕赤酵母(Pichia pastoris)能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长，具有蛋白高表达的特性，不仅拥有真核生物中最强的甲醇诱导型启动子pAOX1，还可以进行高密度发酵，利于工业规模化生产，被认为是最具发展前景的生产蛋白质的宿主之一。建立甲基营养酵母毕赤酵母作为生产燃料、化学品和天然产品的微生物细胞工厂受到越来越多的关注，特别是以甲醇为原料。
[0003]考虑到游离质粒的稳定性和代谢负担问题，通常采用基因组整合来高效表达外源基因。虽然在毕赤酵母中已经建立了CRISPR基因编辑技术，并用于多基因生物合成途径的整合，但仅限于少数的几个例子，且通常需要较长的同源臂(500
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1000bp)，同源臂通常是指打靶载体上待插入的外源序列两侧的与基因组序列完全一致的侧翼序列，用于识别并发生重组的区域。巴斯德毕赤酵母中的同源重组效率较低，通常需要较长的同源片段，随着同源臂长度的降低，编辑效率也会显著下降。因此，利用较短的单链寡核苷酸片段在酵母中实现高效的基因编辑成为研究热点。尽管在一些微生物中已能利用寡核苷酸介导的基因重组对基因组进行定点突变，但在酵母中的低重组效率限制其在酵母基因组进化中的应用。因此，亟需通过基因工程手段进行改造和提升。
[0004]破坏非同源端连接(non
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homologous end joining，NHEJ)相关基因(即KU70基因)已被发现是提高同源重组效率的有效策略，可以显著的提高同源重组的效率，在长同源臂的情况下(1000bp)，三位点同时整合的效率可达到12.5％
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32％(Liu,Q.,Shi,X.,Song,L.,Liu,H.,Zhou,X.,Wang,Q.,Zhang,Y.,and Cai,M.CRISPR
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Cas9
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mediated genomic multiloci integration in Pichia pastoris.Microbial Cell Factories,2019,18,144.doi:10.1186/s12934
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019
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1194
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x)。但KU70基因敲除菌株的转化子会大大减少，且存在染色体末端大片段丢失的可能(Ito,Y.,Watanabe,T.,Aikawa,S.,Nishi,T.,Nishiyama,T.,Nakamura,Y.,Hasunuma,T.,Okubo,Y.,Ishii，J.,and Kondo,A.Deletion of DNA ligase IV homolog confers higher gene targeting efficiency on homologous recombination in Komagataella phaffii.FEMS Yeast Research,2018,18.doi:10.1093/femsyr/foy074)。在不干扰NHEJ的情况下提高同源重组效率是构建毕氏酵母细胞工厂的迫切要求。

技术实现思路

[0005]为了在毕赤酵母中实现具有短同源臂的异源基因的高效基因组整合，我们旨在通过引入酿酒酵母的重组机制来提高其同源重组效率。本专利技术过表达了酿酒酵母的的HR相关基因，包括RAD52基因、RAD59基因、MRE11基因和SAE2基因，并评估它们对基因组整合效率的
影响。同时构建了HR相关基因效率增强型毕赤酵母。
[0006]本专利技术提供了一种增强同源重组能力的酵母基因工程菌，以酵母作为出发菌株，通过导入基因构建获得所述酵母基因工程菌，导入基因包括以下任意一组：(1)RAD52基因、RAD59基因和MRE11基因；(2)RAD52基因和RAD59基因；(3)RAD52基因和MRE11基因；(4)RAD52基因和SAE2基因；(5)RAD52基因；(6)RAD52基因、RAD59基因、MRE11基因和SAE2基因。
[0007]优选的，所述出发菌株为酿酒酵母或毕赤酵母。酿酒酵母可以使用常用的酿酒酵母BY4741，毕赤酵母可以使用常见的毕赤酵母GS115。
[0008]上述的酵母基因工程菌，在导入基因时，RAD52基因整合位点为HIS4位点；RAD59基因整合位点为Int11位点；MRE11基因整合位点为Int20位点；SAE2基因整合位点为Int8位点。HIS4位点为毕赤酵母GS115常用的外源基因整合位点，通过将含有HIS4基因(GeneBank号为8197144)的外源载体线性化后整合到基因组HIS位点，可修复其组氨酸缺陷型。其余位点为申请人挖掘的具有高整合效率的整合位点(表1)。
[0009]所述RAD52基因为来源于酿酒酵母BY4741的RAD52基因或来源于毕赤酵母GS115的RAD52基因，其中，来源于酿酒酵母BY4741的RAD52基因的GeneBank号为854976，来源于毕赤酵母GS115的RAD52基因的NCBI基因编号ID：CAY68760；所述RAD59基因来源于酿酒酵母BY4741，GeneBank号为851500；所述MRE11基因来源于酿酒酵母BY4741，GeneBank号为855264；所述SAE2基因来源于酿酒酵母BY4741，GeneBank号为852700。
[0010]本专利技术还提供了上述酵母基因工程菌的制备方法，导入基因包括RAD52基因、RAD59基因和MRE11基因，所述制备方法包括以下步骤：(1)通过CRISPR/Cas9系统将Cas9核酸酶编码基因整合到毕赤酵母GS115的HIS4位点上，获得菌株Pp；(2)将RAD52基因整合到步骤(1)中获得的菌株Pp的HIS4位点上，获得菌株PpHR1；(3)将RAD59基因整合到步骤(2)中获得的菌株PpHR1的Int11位点上，获得菌株PpHR2；(4)将MRE11基因整合到步骤(3)中获得的菌株PpHR2的Int20位点上，获得菌株PpHR3，即为所述酵母基因工程菌。
[0011]本专利技术还提供了上述酵母基因工程菌在整合异源合成途径的基因中的应用。在整合异源合成途径的基因时，采用同源重组的方式整合，同源重组时采用同源臂的长度至少为40bp。更为优选的，同源重组时采用同源臂的长度为40～1000bp。更为优选的，同源重组时采用同源臂的长度为40～500bp。更为优选的，同源重组时采用同源臂的长度为40bp。
[0012]本专利技术的有益效果：本专利技术的酵母基因工程菌能够实现具有约40bp同源臂的异源基因表达盒的单、二和三基因同时整合，效率分别高达100％、约98％和约81％。同源重组效率增强的巴斯德毕赤酵母菌株可用于构建稳定的细胞工厂，该基因工程策略可用于改造其他非常规酵母。
附图说明
[0013]图1为毕赤酵母增强同源重组机制的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增强同源重组能力的酵母基因工程菌，其特征在于，以酵母作为出发菌株，通过导入基因构建获得所述酵母基因工程菌，导入基因包括以下任意一组：(1)RAD52基因、RAD59基因和MRE11基因；(2)RAD52基因和RAD59基因；(3)RAD52基因和MRE11基因；(4)RAD52基因和SAE2基因；(5)RAD52基因；(6)RAD52基因、RAD59基因、MRE11基因和SAE2基因。2.如权利要求1所述的酵母基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母或毕赤酵母。3.如权利要求1所述的酵母基因工程菌，其特征在于，导入基因时，RAD52基因整合位点为HIS4位点；RAD59基因整合位点为Int11位点；MRE11基因整合位点为Int20位点；SAE2基因整合位点为Int8位点；其中，HIS4位点为毕赤酵母GS115常用的外源基因整合位点；Int11位点为上游ORF为PAS_chr3_1156，下游ORF为PAS_chr3_0154；Int20位点为上游ORF为PAS_chr4_0465，下游ORF为PAS_chr4_0467；Int8位点为上游ORF为PAS_chr2
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1_0528，下游ORF为PAS_chr2
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1_0530。4.如权利要求1所述的酵母基因工程菌，其特征在于，所述RAD52基因为来源于酿酒酵母BY4741的RAD52基因或来源于毕赤酵母GS115的RAD52基因，其中，来源于酿酒酵母BY4741的RAD52基因的GeneBank号为854976，来源于毕赤酵母GS115的RAD52基因的NC...

【专利技术属性】
技术研发人员：连佳长，高炬灿，董昌，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：