提高的植物中的蛋白质表达制造技术

本公开涉及编码感兴趣多肽的合成多核苷酸，这些合成多核苷酸特别适合在靶植物中表达。达。达。

【技术实现步骤摘要】
提高的植物中的蛋白质表达
[0001]本申请是申请号为201580004736.9(申请日：2015年1月16日，专利技术名称：提高的植物中的蛋白质表达)的中国专利申请的分案申请。
[0002]优先权声明
[0003]本申请要求获得于2014年1月17日提交的题为
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提高的植物中的蛋白质表达
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(INCREASED PROTEIN EXPRESSION IN PLANTS)美国临时专利申请系列号/61/928,852的利益。


[0004]本公开涉及用于提高多核苷酸在植物细胞内的表达的方法和组合物。在一些实施方案中，多核苷酸的蛋白质编码区被修饰以反映来自宿主生物体的密码子使用偏好，同时保留天然基因中的某些多聚腺苷酸化序列。
[0005]背景
[0006]遗传密码由三核苷酸单位(
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密码子
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)构成。有64个可能的密码子，每一个密码子指定20种氨基酸中的一种氨基酸，或者指示转录的终止(即
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终止密码子
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)。因此，至少有一些密码子是冗余的。在绝大多数生物使用的编码系统中，有两种氨基酸是由单个密码子编码的，而所有其他种的氨基酸是由2、3、4或6个密码子编码的，还有3个终止密码子。对于具有2、3、或4个密码子的氨基酸，其各个密码子在第三个核苷酸位置上不同。对于3种具有6个密码子的氨基酸，它们有一组4个密码子遵循这一模式，同时还有另一组2个密码子则在第二个核苷酸位置上不同。对于由6个密码子代表的两种氨基酸(Arg和Leu)，它们分别由一组在第2个核苷酸位置不同的密码子所代表。丝氨酸(Ser)的密码子表示是不同寻常的：两组密码子都非常相似。对于由2个密码子表示的氨基酸，在两种情况下第三位都是嘌呤(A，G)或嘧啶(C，T)。
[0007]遗传密码的简并性为构建编码参考多核苷酸多肽产物的可替代多核苷酸提供了机会。例如，密码子简并性允许人们制造这样的合成DNA序列：其编码感兴趣的蛋白质，但是使用的密码子与原始DNA编码序列中的不同。对于一种特定的氨基酸而言，给定的生物体对可能的密码子的使用不是均等的。每种生物在密码子使用上都有偏好。对于生物体及其近亲而言，整个基因组上密码子使用偏好的模式是独特的。例如，在链霉菌属中，常用密码子一般在第三核苷酸位置上包括G或C。稀有密码子一般在第三核苷酸位置上包括A或T。在其它生物中，A或T是第三位置优选的。在特定的物种内，某些独特类别的基因可能具有其自身的密码子偏好。例如在大肠杆菌中大致有三类基因，它们各自具有独特的密码子使用特征。一类多见于大量表达的重要蛋白中；第二类包括以相对低水平表达的蛋白质；而第三类包括可能是近期从其他物种获得的蛋白质。
[0008]为了在转基因植物中实现异源蛋白质的期望表达水平，已经发现以各种方式改变天然(有时被称为野生型或原始)DNA编码序列，从而使例如密码子使用更密切地匹配宿主植物物种的密码子使用，和/或使编码序列的G+C含量更密切地匹配宿主植物物种编码序列中通常发现的G+C水平，和/或除去某些使mRNA不稳定的序列，是有利的。例如，使用一种或
多种这样的方法已经提高了苏云金芽孢杆菌(Bt)晶体蛋白昆虫毒素在植物中的表达。参见例如美国专利5,380,301；美国专利5,625,136；美国专利6,218,188；美国专利6,340,593；美国专利6,673,990；和美国专利7,741,118。
[0009]在大多数合成基因的设计策略中，过程试图使合成基因的密码子组成与待表达该合成基因的宿主的基因的密码子组成相匹配。参见，例如，美国专利公开No.US 2007/0292918 A1。这样的策略在某些情况下可能导致合成基因在宿主中的表达提高。例如，酵母中的密码子优化可以最小化例如限制氨基酰
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tRNA以及富AT序列处的转录终止等的影响，由此显著提高异源基因转录本的翻译。参见例如Daly and Heam(2004)J.Mol.Recognition 18：119
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38。
[0010]然而，尽管在本领域中公认某种形式的密码子优化是必要的，但是从业者对于优化应当采用的一般策略并未达成一致。某些人喜欢的一种策略是在异源基因的设计过程中最大限度地使用表达宿主物种中的常用密码子。另外一些人更喜欢这样一种策略，即对特定密码子的上下文给予最大重视，从而使在表达宿主中经常出现的密码子对(codon pairs)的使用最大化。第三种策略是使新物种中新编码序列的密码子使用与原始物种中参考编码序列的密码子使用相似。该第三种策略高度重视发现对稀有密码子的可能需求，以确保转录本RNA分子具有适当的二级结构。此外，在异源序列中简单地重复使用同一种高频密码子预期最终会产生与选用稀有密码子相同的后果，例如，过度使用相应的tRNA会限制该tRNA的可用性。试图为在宿主生物体中表达而优化基因序列的密码子的人必须平衡这些策略和它们背后的关注点，才能找到具体的方法。
[0011]优化编码异源表达蛋白的核苷酸序列的过程对于提高表达产量可能是一个重要步骤。然而，有一些潜在问题限制了特定基因的表达优化的用处。例如，经优化的转录本的二级结构可能会限制转录本的翻译。Griswold et al.(2003)Protein Expression and Purification 27：134
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42。此外，有许多序列基序在用于异源表达的合成序列中是期望避免的，包括：大肠杆菌中的I类和II类转录终止位点(对于由T7启动子控制的基因而言)；Shine
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Dalgamo样序列；潜在的剪接信号；促进核糖体移框和序列暂停的序列；和多聚腺苷酸化信号。Welch et al.(2010)J.R.Soc.Interface 6：S467
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76。特别地，本领域中的观点是，为了提高合成基因在植物中的表达，应当减少多聚腺苷酸化信号序列。美国专利7,741,118。
[0012]公开
[0013]与本领域的观点相反(参见例如美国专利7,741,118)，我们最近发现，减少多聚腺苷酸化信号序列(例如AATAAA，AATAAT，AACCAA，ATATAA，AATCAA，ATACTA，ATAAAA，ATGAAA，AAGCAT，ATTAAT，ATACAT，AAAATA，ATTAAA，AATTAA，AATACA，和CATAAA)的数目对于提高合成基因在植物内的表达既不是必要的也不是充分的。本文的实施方案将一个令人惊讶并且出人意料的结果投入了现实应用，该结果是：在基因优化过程中，这些多聚腺苷酸化序列在合成编码序列中的保留(就它们在天然序列中的出现而言)可以利用来增加异源蛋白质表达。
[0014]本文的实施方案包括编码至少一种感兴趣多肽的合成核酸。在实施方案中，根据特定基因设计参数的约束设计了编码至少一个感兴趣多肽的合成核酸，这些基因设计参数一般性地增加宿主(例如植物细胞、植物组织和植物)中来自该核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于在植物的细胞中表达感兴趣的异源多肽的系统，该系统包括：参考多核苷酸，其来自不同于该植物的生物的基因组且编码所述感兴趣多肽；和合成多核苷酸，其具有这样的序列，该序列包含：编码所述感兴趣多肽的序列，其中该序列已经过密码子优化而除去了所有根据该植物的密码子偏好为稀有的密码子，至少一个选自下组的多聚腺苷酸化序列：AATAAA，AATAAT，AACCAA，ATATAA，AATCAA，ATACTA，ATAAAA，ATGAAA，AAGCAT，ATTAAT，ATACAT，AAAATA，ATTAAA，AATTAA，AATACA，和CATAAA，其中该多腺苷酸序列以与所述参考多核苷酸中相同的数目及相同的位置存在，并且其中该合成多核苷酸序列不以与所述参考多核苷酸中相异的数目或位置包含任何选自下组的多聚腺苷酸化序列：AATAAA，AATAAT，AACCAA，ATATAA，AATCAA，ATACTA，ATAAAA，ATGAAA，AAGCAT，ATTAAT，ATACAT，AAAATA，ATTAAA，AATTAA，AATACA，和CATAAA。2.权利要求1的系统，其中该合成多核苷酸不包含下组之外的任何多聚腺...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：