反式激活目的基因的同源基因的方法和诊断疾病的体外方法技术

本发明专利技术涉及反式激活至少一种目的基因的同源基因以及任选地失活至少一种目的基因的方法，其中由至少一种目的基因编码的mRNA与对照相比包含突变，并且其中该方法包括本申请中描述的步骤。本发明专利技术还涉及一种诊断疾病的体外方法，其中该方法包括以下步骤:a)诱导由从受试者获得的细胞或组织样品中的至少一种目的基因编码的mRNA的表达；b)分离步骤a)的mRNA；c)分析步骤b)的分离的mRNA的序列，以及d)从而检测与对照相比mRNA的突变，这表明疾病的存在。在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】al.,2008,Kefalov 2012,Sakurai et al.,2007,Shi et al.,2007)。这表明激活视杆细胞中编码视锥视蛋白的基因可以补偿相应小鼠模型中有缺陷的视紫红质。这同样适用于视杆和视锥CNG通道亚基，它们已被证明在异源表达系统中在功能上相互补偿(Finn et al.,1998,Gerstner et al.,2000,Sautter et al.,1998)。
[0005]视紫红质基因(RHO)的突变是常染色体显性RP(adRP)的主要原因。相比之下，编码视锥CNG通道亚基(CNGA3和CNGB3)的基因突变是ACHM最常见的原因。缺乏视紫红质(Rho
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)或Cnga3(Cnga3
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)的小鼠模型分别强烈反映了adRP和ACHM的临床表型(Biel et al.,1999,Humphries et al.,1997)。
[0006]在过去的几十年中，许多不同的方法被开发出来对抗IRD，如RP或ACHM(Scholl et al.,2016)。从临床角度来看，目前最流行的金标准方法是经典的基因补充疗法，该疗法已成功应用于不同的视网膜变性小鼠模型(Boye et al.,2013,Koch et al.,2012,Michalakis et al.,2010)。在所有这些研究中，重组腺相关病毒(rAAV)载体用于视网膜中相应基因的有效递送和长期表达。AAV是细小病毒衍生的小型病毒，其用作递送目的基因的正确拷贝的媒介物。尽管AAV提供了许多优点(即，高转导效率、长期表达而无需基因组整合、无毒性或非常低的毒性、良好的免疫耐受性)，但它们也具有一些重要的缺点，这阻碍了它们在经典基因补充疗法中的更广泛应用。rAAV载体的一个重要缺点是它们有限的基因组包装能力(大约4.7kb，包括启动子和反向末端重复序列(ITRs)(Wu et al.,2010))。然而，许多IRD是由编码序列远远超过AAV包装限制的基因引起的，例如USH2A、MYO7A、ABCA4、CACNA1F、CDH23、GPR98、EYS、RP1或PRPH8。因此，仍需要开发策略以克服AAV的这一重要限制。
[0007]一种治疗遗传疾病的开创性方法是CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)/Cas9基因组编辑技术。DNA靶向核酸内切酶Cas9可以通过称为引导RNA(gRNA)的短互补RNA分子被募集到基因组内的特定基因座。在以前的工作中，为了进一步拓宽Cas9酶的应用范围，已经开发了核酸内切酶缺陷型Cas9变体(称为“死”Cas9，dCas9)(Sander&Joung 2014,Wang et al.,2016))。其中，这些修饰的Cas9变体的应用范围包括在体外和体内对基因的有效激活(Sander&Joung 2014)。为此，dCas9在C端与转录因子的反式激活结构域融合。在最近的一项研究中，不同CRISPR/Cas9基因激活结构域的效率已经针对多种不同细胞类型中的几种基因进行了比较。在这种情况下，一个特定的基因激活结构域(VPR，杂合VP64
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p65
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Rta三元激活物(Chavez et al.,2015))在所有实验和所有测试物种中显示出最高的基因激活效率。此外，这项研究还证明了gRNA在相应基因的启动子区域中的结合位置影响基因激活的效率。最后，还表明gRNA数量的增加改善了基因的激活(Chavez et al.,2016)。
[0008]然而，尽管dCas9 VPR方法在体外非常有前景和有效，但其在视网膜和其他组织中的治疗应用受到缺乏有效递送技术的阻碍。由于其大小(5.8kb)，dCas9
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VPR远远超过了rAAV载体的DNA包装能力。过去，已经开发了多种方法来绕过rAAV的这种限制(Chamberlain et al.,2016,Flotte 2000)。这些方法基于在DNA、mRNA或蛋白质水平上对分裂的rAAV转基因进行转录前或转录后重组。
[0009]迄今为止，已经发现了60多种不同的IRD基因。尽管基因诊断已经有了实质性的改进，但是仍然有大量(高达40％)的IRD患者没有明确的基因诊断(Audo et al.,2012,Shanks et al.,2013)。缺乏基因诊断的潜在原因可能是技术限制或患者携带未知基因的
致病突变。此外，在没有明确遗传诊断的常染色体隐性IRD患者中，有很高比例的患者在单个基因中仅携带一个突变，例如在与Leber先天性黑蒙症(LCA)、Usher综合征(USH)或Stargardt病(STGD)相关的关键基因中。这些患者很可能在同一基因的非编码区携带第二个突变，这是标准诊断组没有检测到的。
[0010]下一代测序技术，如全基因组测序(WGS)或全外显子组测序(WES)，促进了遗传疾病的诊断。然而，WGS和WES都有关键的局限性。WES不包括非外显子区域(内含子、启动子或其他调控转录元件)，这些区域对mRNA的稳定性和/或加工至关重要。WGS在时间和金钱方面仍然是昂贵的，并且在此过程中获得的大数据的解释是具有挑战性的，并且必须由训练有素的生物信息学家来完成。即使使用WGS可以在候选基因的外显子或非外显子区域鉴定出潜在的致病突变，这些突变如何影响mRNA水平的实验验证也是不可或缺的。
[0011]单核苷酸改变可以通过不同的机制影响mRNA。其中，最常见的机制是mRNA剪接的改变(Baralle&Buratti 2017,Kim et al.,2018)。经典剪接突变是那些影响已知剪接位点的共有序列的突变。这些突变通常通过上述方法(WGS和/或WES)检测，并使用标准剪接预测软件分类为剪接突变。然而，除了那些影响外显子侧翼的前两个内含子核苷酸的突变(GT对AG)外，将突变分类为剪接突变通常需要在受影响细胞中或在基于小基因的测定中进行mRNA水平上的实验验证，所述测定在通常可获得的细胞系中表达相应的基因片段。除了假阳性结果，剪接预测软件也可能产生不确定数量的假阴性记录。通常，这些“假阴性”剪接突变位于较深的外显子编码区，在那里剪接预测相当具有挑战性(Grodecka et al.,2017,Ohno et al.,2018)。通常，预测影响保守和/或功能重要氨基酸的(深)外显子点突变被归类为错义变体。然而，无论其类型如何，致病突变也可能导致异常剪接，这是一个很大程度上未经探索的选择。此外，识别剪接突变对于为受影响的个体开发合适的治疗方案也很重要。因为与IRD相关的剪接突变可以例如用反义寡核苷酸治疗(Bergsma et al.,2018,Godfrey et al.,2017)，这种突变的鉴定也将对未来疗法的开发产生强烈的影响。
[0012]利用WGS，一些出版物鉴定出IRD患者的深度内含子(剪接)突变(Bax et al.,2015,Braun et al.,2013,Carss et al.,本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种反式激活至少一种目的基因的同源基因并任选失活至少一种目的基因的方法，其中由所述至少一种目的基因编码的mRNA与对照相比包含突变，其中所述方法包括以下步骤:
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复合物的结合，所述复合物包括天然或遗传修饰的DNA结合蛋白，转录激活因子或转录因子的至少一个反式激活结构域，以及至少一种引导RNA,其中所述至少一种引导RNA与所述至少一种目的基因的同源基因的启动子区域结合，或者与调节由所述至少一种目的基因的同源基因编码的mRNA的表达的其他元件结合，任选地，其中另一种引导RNA结合编码区、启动子区和/或调节由至少一种目的基因编码的mRNA表达的其它元件；并且，其中所述至少一种目的基因选自由如下组成的组：视蛋白基因、环核苷酸门控通道(CNG)基因、视黄醛特异性ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)基因和肌球蛋白基因；
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诱导由所述至少一种目的基因的同源基因编码的mRNA的表达；
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任选地使由所述至少一种目的基因编码的mRNA的表达失活；和
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从而反式激活所述至少一个目的基因。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括诱导由所述至少一种目的基因的同源基因的mRNA编码的蛋白质的表达，并分析由所述mRNA编码的至少一种蛋白质的序列、表达水平、定位或功能。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种目的基因的同源基因选自由如下组成的组：ABCA1(SEQ ID NO:1)、ABCA2(SEQ ID NO:3)、ABCA7(SEQ ID NO:7)、ABCA12(SEQ ID NO:9)、ABCA13(SEQ ID NO:11)、CNGA1(SEQ ID NO:13)、CNGA2(SEQ ID NO:15)、CNGA3(SEQ ID NO:17)、CNGA4(SEQ ID NO:19)、CNGB1(SEQ ID NO:21)、CNGB3(SEQ ID NO:23)、MYO7B(SEQ ID NO:33)、MYO5A(SEQ ID NO:25)、MYO5B(SEQ ID NO:27)、MYO5C(SEQ ID NO:29)、MYO10(SEQ ID NO:35)、MYO15B(SEQ ID NO:39)、MYO15A(SEQ ID NO:37)、OPN1LW(SEQ ID NO:41)、OPN1MW(SEQ ID NO:43)和OPN1SW(SEQ ID NO:45)。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述天然或遗传修饰的DNA结合蛋白选自由如下组成的组：Cas酶；优选Cas9(SEQ ID NO:92)、dCas9
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酶(SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97)、Cas12a(SEQ ID NO:93)或Cas12b(SEQ ID NO:94)；锌指核酸酶；和转录激活因子样核酸酶；和/或其中转录激活因子或转录因子的至少一个反式激活结构域选自由如下组成的组：VPR(SEQ ID NO:89)、SAM(SEQ ID NO:90)、SunTag(SEQ ID NO:91)、VP64(SEQ ID NO:73)、p65(SEQ ID NO:74)、Rta(SEQ ID NO:75)及其组合；优选地，其中所述天然或遗传修饰的DNA结合蛋白的核苷酸序列和所述转录激活因子或转录因子的至少一个反式激活结构域的核苷酸序列被分成两个分裂片段。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述天然或遗传修饰的DNA结合蛋白的核苷酸序列和所述转录激活因子或转录因子的至少一个反式激活结构域的核苷酸序列位于两个独立的质粒和/或载体上。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使用天然或工程化来源的重组AAV载体，优选具有视网膜细胞类型向性和增强的视网膜转导效率的AAV载体变体。7.一种复合物，其包含天然或遗传修饰的DNA结合蛋白、转录激活因子或转录因子的至少一个反式激活结构域和至少一个引导RNA，所述复合物用于治疗遗传性视网膜营养不良(IRD)的方法中，所述遗传性视网膜营养不良是由于选自由如下组成的组的至少一种目的基因的突变：视蛋白基因、环核苷酸门控通道(CNG)基因、视网膜特异性ATP结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)基因和肌球蛋白基因，所述方法包括反式激活所述至少一种目的基因的同源基因，以及任选地失活所述至少一种目的基因；其中所述至少一个引导RNA与所述至少一种目的基因的同源基因的启动子区域或者与调...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂利亚诺斯，
申请(专利权)人：维格内罗有限责任公司，
类型：发明
国别省市：