一种产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：1)将80％以上菌体形成芽孢的凝结芽孢杆菌转入无菌水中，形成种子培养液；2)将种子培养液转接到一级液体培养基中进行一级发酵，制成一级发酵液；3)将一级发酵液转接到二级液体培养基中进行二级发酵，制成二级发酵液；4)将二级发酵液接入麸皮固体培养基中，混合均匀后培养60～72h，制备得到产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂。本发明专利技术提供了适用于凝结芽孢杆菌的液体培养基及液体培养产芽孢条件，且制得的产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂每克含83～132亿个活菌，芽孢出芽率不低于92％，杂菌率＜0.2％，且L

【技术实现步骤摘要】
一种产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂的制备方法


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂的制备方法。

技术介绍

[0002]微生物制剂因其具有调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高机体健康水平及生产性能、能够避免服用抗生素带来的耐药性和二重感染等功能，子啊畜牧业中的应用已得到了业界的广泛认可。但是，目前国内常见的乳酸菌和芽孢杆菌等微生物制剂往往难以兼备生产性能优良和抗逆性强的双重优点，使得这类添加剂在实际中的应用受到了限制。
[0003]凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的优势在于能形成耐热性和耐酸性较强的芽孢，其芽孢作为活性因子耐受胃酸顺利到达肠胃并定植存活的能力也较强，能够在厌氧条件下产生L
‑
乳酸。这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率和防病促进生长起到重要作用。除具有优良生产性能外，同时还具有抗逆性强、耐高温高压、易贮存等独特的生物特性，正在成为目前饲料添加剂行业的又一新宠，因此在饲料中添加能够产L
‑
乳酸的凝结芽孢杆菌是一个十分绿色健康的选择。
[0004]目前制备凝结芽孢杆菌微生物制剂一般采用敞开式麸皮固态的传统发酵工艺，采用自然风，自然温度、湿度，其制备的凝结芽孢杆菌微生物制剂中，杂菌率高，活菌数波动大。虽然凝结芽孢杆菌在多种固体培养基上形成芽孢良好，但在普通液体培养基中却不能形成芽孢，且固体培养的局限性必将妨碍其扩大生产及其实际应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术中存在的技术问题，提供一种产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂的制备方法。
[0006]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0007]一种产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0008]1)将活化的80％以上菌体形成芽孢的凝结芽孢杆菌转入无菌水中，使其浓度为5.0
×
108cfu/ml～2.0
×
109cfu/ml，形成种子培养液；
[0009]2)将种子培养液以3％～5％的接种量转接到一级液体培养基中进行一级发酵，发酵温度37
±
1℃，搅拌速率200～350rpm，通气量0.8～0.9V/V
·
min，溶氧浓度80～90％，发酵时间为8～16h，制成一级发酵液；
[0010]3)将一级发酵液以10％的接种量转接到二级液体培养基中进行二级发酵，发酵温度37
±
1℃，搅拌速率150～250rpm，通气量0.8～0.9V/V
·
min，溶氧浓度70～80％，发酵时间为12～30h，使凝结芽孢杆菌生长至对数生长末期，制成二级发酵液；
[0011]4)在无菌环境中，将二级发酵液以2％～4％的接种量接入麸皮固体培养基中，混合均匀，控制通风量为：换气3～10次/小时，温度30～40℃，湿度80％～90％条件下培养60
～72h，培养期间翻动麸皮固体培养基，由此制备得到产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂；
[0012]其中，一级和二级液体培养基均含MnSO
4 0.5～2.0g/L、MgSO
4 0.4～1.0g/L、KH2P0
4 0.5～3g/L、K2HP0
4 0.5～3g/L、NaCl 3～10g/L、蛋白胨5～20g/L和牛肉膏3～10g/L，且pH为7.0
±
1.0；麸皮固体培养基由以下按质量份数计的原料混合配制而成：麸皮40～90份、鱼粉0.1～2份、硫酸铵0.1～0.6份、磷酸氢二钾0.1～0.6份、硫酸锰0.1～0.5份和水10～60份。
[0013]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0014]进一步，步骤1)中，制备种子培养液的具体操作如下：首先将凝结芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基试管斜面，37℃下培养24h，然后接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基茄子瓶斜面，37℃下培养至80％以上菌体形成芽孢时，再转入无菌水中，使其形成浓度为5.0
×
108cfu/ml～2.0
×
109cfu/ml的种子培养液。
[0015]进一步，所述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基含蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、NaCl 5g/L和琼脂15～20g/L，且pH为6.8～7.0。
[0016]进一步，步骤4)中，培养期间每隔3～5h翻动一次麸皮固体培养基。
[0017]进一步，步骤4)中，将制备得到的产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂经55～60℃真空干燥处理后，包装成成品，成品检测合格后，可作为微生物制剂产品。
[0018]进一步，步骤2)和3)中，一级和二级液体培养基在接种前，于121℃条件下，灭菌20min。
[0019]进一步，步骤4)中，麸皮固体培养基的配制方法为：将硫酸铵、硫酸氢二钾和硫酸锰先用水溶再与其余固体原料混合，搅拌均匀后，在压力、温度分别为1.05～1.3Kg/cm3、121～125℃的条件下，灭菌30～40min，冷却至40～50℃即得麸皮固体培养基，备用。
[0020]本专利技术的有益效果是：
[0021](1)本专利技术优化了发酵培养基，将80％以上菌体形成芽孢的凝结芽孢杆菌作为种子培养液接种到液体培养基中，在合适的条件下进行一级和二级发酵，再以二级发酵液接种到麸皮固体培养基中，在合适条件下进行培养，使得凝结芽孢杆菌一直处于有氧条件下，进行高密度的发酵，形成大量的芽孢，同时避免杂菌的影响。
[0022](2)本专利技术有效的解决了现有技术中麸皮发酵过程中的杂菌过多、通风、散热不均匀温度不恒定等问题，大大提高了凝结芽孢杆菌的活菌数，经检测，按照本专利技术方法制备得到的产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂，其每克微生物制剂含活菌数为83～132亿个活菌，芽孢出芽率不低于92％，杂菌率＜0.2％，且L
‑
乳酸含量不低于36.5g/L。
[0023](3)本专利技术提供了适用于凝结芽孢杆菌的液体培养基及液体培养产芽孢条件，对奠定凝结芽孢杆菌微生物制剂的工业化生产具有一定的现实意义，有望解决凝结芽孢杆菌在普通液体培养基中不能形成芽孢、固体培养的局限性妨碍其扩大生产及实际应用的问题。
具体实施方式
[0024]以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0025]除非另有说明，本专利技术采用的原料及设备为本
常规原料及设备(常规市
售品)，皆可于市场购得。例如，实施例1
‑
10中凝结芽孢杆菌的冻干种是购买所得，是现有生物材料，其保藏编号为GDMCC 1.645，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心。
[0026]实施例1
[0027]从凝结芽孢杆菌的冻干种上挑取一环菌体接种至牛肉膏蛋白胨琼脂试管斜面培养基中，37℃培养24小时；再将试管斜面种子转接到牛肉膏蛋白胨琼脂茄子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将活化的80％以上菌体形成芽孢的凝结芽孢杆菌转入无菌水中，使其浓度为5.0
×
108cfu/ml～2.0
×
109cfu/ml，形成种子培养液；2)将种子培养液以3％～5％的接种量转接到一级液体培养基中进行一级发酵，发酵温度37
±
1℃，搅拌速率200～350rpm，通气量0.8～0.9V/V
·
min，溶氧浓度80～90％，发酵时间为8～16h，制成一级发酵液；3)将一级发酵液以10％的接种量转接到二级液体培养基中进行二级发酵，发酵温度37
±
1℃，搅拌速率150～250rpm，通气量0.8～0.9V/V
·
min，溶氧浓度70～80％，发酵时间为12～30h，使凝结芽孢杆菌生长至对数生长末期，制成二级发酵液；4)在无菌环境中，将二级发酵液以2％～4％的接种量接入麸皮固体培养基中，混合均匀，控制通风量为：换气3～10次/小时，温度30～40℃，湿度80％～90％条件下培养60～72h，培养期间翻动麸皮固体培养基，由此制备得到产乳酸凝结芽孢杆菌微生物制剂；其中，一级和二级液体培养基均含MnSO40.5～2.0g/L、MgSO40.4～1.0g/L、KH2P040.5～3g/L、K2HP040.5～3g/L、NaCl 3～10g/L、蛋白胨5～20g/L和牛肉膏3～10g/L，且pH为7.0
±
1.0；麸皮固体培养基由以下按质量份数计的原料混合配制而成：麸皮40～90份、鱼粉0.1～2份、硫酸铵0.1～0.6份、磷酸氢二钾0.1～0.6份、硫酸锰0....

【专利技术属性】
技术研发人员：江永明，吴峰，
申请(专利权)人：鑫九通科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：