一种细菌响应性微针贴片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种细菌响应性微针贴片及其制备方法和应用，微针贴片由微针贴片、细菌响应性载药纳米颗粒、聚合物基质组成。明胶纳米粒子自组装并通过脱水缩合反应与抗菌肽耦合，形成细菌响应性载药纳米颗粒AMP

【技术实现步骤摘要】
一种细菌响应性微针贴片及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种细菌响应性微针贴片及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]慢性伤口，如糖尿病足、压疮、肿瘤伤口和手术部位感染不愈合，严重危及人们的身心健康，并造成巨大的医疗负担。创伤发生后，机体会产生一系列的生理事件来修复损伤，包括止血、炎症、增殖和重塑，细菌感染后会干扰这四个伤口愈合级联的正常协调过程，且细菌诱导的严重伤口感染往往伴随着生物膜的存在。细菌生物膜已被确定为慢性伤口的主要原因。生物膜是附着在受伤组织表面的细菌集合，它很难被机体的免疫机制清除，且对抗生素治疗不敏感。
[0003]在“后抗生素时代”的阴影下，虽然许多抗菌策略对浮游细菌有效，但大多数抗菌药物不能处理生物膜。载有抗菌药物的微针贴片(MN)可以实现抗菌治疗和组织再生，被公认为对抗皮肤慢性伤口的最有效方法之一。具有适当长度的MN可以穿透表皮在皮肤中形成通道，同时避免与毛细血管和神经接触，具有微创和无痛的递送策略，可到达皮肤下形成的生物膜。研究人员开发了多种MN，这些MN由抗菌材料组成，例如壳聚糖、抗菌银纳米颗粒、抗菌肽(AMP)、和生物活性提取物等。例如，已开发出含有抗菌剂氯霉素的MN，并用于处理细菌生物膜。MN可以穿透生物膜并促进氯霉素响应细菌群落的释放，从而显着降低药物的脱靶毒性。因此，装有活性再生剂和抗菌药物的MN有望对抗感染引起的慢性伤口。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种能有效抗菌且促进伤口愈合的细菌响应性微针贴片及其制备方法和应用，将功能性纳米材料与MN结合开发一种由物理惰性聚合物PVP K
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30和重组III型胶原蛋白制成的可降解微针贴片，可将抗菌药物递送至感染慢性伤口的病灶部位。本专利技术制备的微针贴片具有较好的促伤口愈合效果，在抑菌、细菌感染伤口的光热治疗方面均有广泛的应用前景。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]本专利技术提供的细菌响应性微针贴片由微针贴片、细菌响应性载药纳米颗粒AMP
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Cypate@GNP和聚合物基质组成；
[0007]聚合物基质由生物相容性良好的物理惰性聚合物PVP K
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30和重组人III型胶原蛋白(Col III)组成，其制备方法为：将PVP溶于超纯水中(1g PVP加1mL超纯水)，加入Col III 0.20g混合，配置成混合溶液，4℃保存备用。
[0008]细菌响应性载药纳米颗粒AMP
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Cypate@GNP是由明胶纳米颗粒(GNP)自组装并通过脱水缩合反应与抗菌肽(AMP
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Cypate)耦合形成。明胶纳米颗粒表面含有氨基，抗菌肽序列N端有羧基，通过氨基与羧基脱水缩合反应偶联制得细菌响应性载药纳米颗粒AMP
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Cypate@GNP，具体步骤如下：
[0009]首先，使用MBHA树脂5倍当量的氨基酸，加入HBTU和HOBt并在DMF中激活偶联，每次持续45分钟。
[0010]其次，使用哌啶/DMF(20％,v/v)脱去氨基酸上的Fmoc保护基团，每次持续30分钟。重复上述步骤直至序列合成，再使用TFA/TIS/DCM(1:5:94)将序列N端的Fmoc基团切割掉，N端暴露的氨基与5倍过量的游离Cypate在DIPEA存在的情况下偶联12小时，形成序列AMP
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Cypate。通过TFA、EDT、去离子水和TIS(94:2.5:2.5:1,v/v/v/v)的裂解混合物将肽链AMP
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Cypate从树脂上切割下来，并通过高效液相进行制备纯化。AMP
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Cypate的分子量通过LC
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MS确认：m/z计算为[M+2H]2+
1076.9，实测值1076.3。
[0011]最后，将5mL GNP(4mg/mL)、2mg EDC和2mg NHS在pH≈7下连续搅拌30分钟，以激活明胶纳米颗粒的羧基。将AMP
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Cypate滴加到GNP溶液中。将pH值调至7后，将混合物超声处理30分钟。最后，将溶液离心除去未反应的AMP
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Cypate，用PBS洗涤3次，冻干得到AMP
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Cypate@GNP。
[0012]本专利技术还提供了上述微针贴片的制备方法，具体为：
[0013](1)将约0.2mL浓度为10μg/mL载药纳米颗粒(AMP
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Cypate@GNP)的乙醇悬浮液浇注到装载有微针贴片的模具上，将覆盖的模具以2000g离心并在空气流下干燥，该过程重复三遍；
[0014](2)将约1mL聚合物基质溶液浇注到微针模具上，将模具以2200g离心15分钟；在37℃的烘箱中干燥48小时后，小心地剥离微针贴片，将所得微针贴片储存在密封的孔板中以供进一步研究。
[0015]本专利技术细菌响应性微针贴片由载药纳米颗粒和聚合物基质组成。明胶分子可以自组装并通过脱水缩合反应与抗菌肽耦合，形成AMP
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Cypate@GNP，并与微针贴剂进一步整合。当应用到感染部位时，微针就会穿透EPS并物理破坏细菌生物膜的结构。在聚合物微针快速溶解后，GNP暴露于由常驻微生物产生的明胶酶而解离，从而导致接枝的AMP
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Cypate触发释放到细菌生物膜基质中。与传统的AMP
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Cypate局部使用相比，具有新型酶感应基质的智能贴片为慢性伤口感染提供了一种有效的潜在治疗方法。
[0016]相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0017](1)本专利技术包含的细菌响应性载药纳米颗粒AMP
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Cypate@GNP是通过Fmoc固相合成法制备抗菌肽，并将荧光染料Cypate复合偶联在抗菌肽上。抗菌肽AMP
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Cypate合成后，再采用去溶剂法合成GNP，并通过脱水缩合将明胶纳米粒与Cypate偶联的肽链结合。载药纳米粒中引入荧光染料Cypate进行光热(PTT)抗菌，与抗菌肽(AMP)产生协同抗菌作用。
[0018](2)本专利技术微针贴片制备简单，成本低廉，为大规模制备奠定了基础。
[0019](3)微针材料包含抗菌颗粒和胶原蛋白，可以穿透细菌生物膜，而负载的抗菌颗粒仅响应细菌群落的活性而释放，非常适用于治疗伤口和其他容易感染的部位。
附图说明：
[0020]图1为载药纳米颗粒AMP
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Cypate@GNP的透射电子显微镜(TEM)照片；
[0021]图2为微针贴片的数码照片；
[0022]图3为微针贴片的扫描电子显微镜(SEM)图片；
[0023]图4为罗丹明B(Rho)标记的微针贴片装载FITC标记的GNP的荧光倒置显微镜图像。
(明胶纳米粒沉积在微针针尖，显示绿色，微针基质显示红色)；
[0024]图5为载药纳米颗粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细菌响应性微针贴片，其特征在于，所述细菌响应性微针贴片由微针贴片、细菌响应性载药纳米颗粒AMP
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Cypate@GNP和聚合物基质组成。2.如权利要求1所述的细菌响应性微针贴片，其特征在于，所述细菌响应性载药纳米颗粒AMP
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Cypate@GNP是由明胶纳米粒子(GNP)自组装并通过脱水缩合反应与抗菌肽(AMP
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Cypate)耦合形成。3.如权利要求2所述的细菌响应性微针贴片，其特征在于，所述抗菌肽AMP
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Cypate的制备方法为：使用Fmoc固相合成法合成抗菌肽序列GKRWWKWWRR，再利用脱水缩合反应将荧光染料Cypate偶联至抗菌肽上合成最终序列GKRWWKWWRR
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Cypate，简称AMP
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Cypate。4.如权利要求1所述的细菌响应性微针贴片，其特征在于，所述聚合物基质由物理惰性聚合物PVP K
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30和重组人III型胶原...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建浩，雷晓玲，周心霈，李孟金，邱琳，周舒文，崔朋飞，王程，高子涵，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：