一种制备诱导性间充质干细胞的方法技术

一种制备诱导性间充质干细胞的方法，包括：干细胞培养步骤，包括提供间充质干细胞培养得到诱导性间充质干细胞；分化步骤，包括将诱导性多能干细胞分化培养为间充质干细胞，即为诱导性间充质干细胞(iMSCs)。该方法不需要饲养层细胞和胎牛血清，操作简单，避免了外源基因组整合风险，能够高效稳定地制备出人类iMSCs细胞株。iMSCs细胞株。iMSCs细胞株。

【技术实现步骤摘要】
一种制备诱导性间充质干细胞的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种制备诱导性间充质干细胞的方法。

技术介绍

[0002]目前，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)作为细胞应用，依然存在两大技术瓶颈，第一是细胞数量有限。间充质干细胞主要从骨髓、脂肪、脐带等机体组织中分离制备而来，然而组织中MSCs含量较低，临床应用前需要进行大量的细胞扩增过程，而体外扩增过程同样会引起细胞不同程度的衰老状态，表现出增殖能力降低等，且收获的细胞数量难以满足临床移植需求。第二个是非组织来源MSCs制备依然是技术挑战，尽管目前有研究利用胚胎干细胞(ESCs)或诱导性多能干细胞(iPSCs)进行MSCs分化研究，然而胚胎干细胞引发伦理纠纷风险，而诱导性多能干细胞往往使用病毒整合体系具有基因组整合风险，此外iPSCs分化来源的MSCs(iMSCs)依赖于使用动物血清及多重生物小分子的处理，且程序复杂、2D扩增细胞出现高度异质性等难题，上述环节限制了iMSCs的进一步临床应用。

技术实现思路

[0003]根据第一方面，在一实施例中，提供一种制备诱导性间充质干细胞的方法，包括：
[0004]干细胞培养步骤，包括提供间充质干细胞，培养得到诱导性多能干细胞；
[0005]分化步骤，包括将诱导性多能干细胞分化培养为间充质干细胞，即为诱导性间充质干细胞(iMSCs)。
[0006]根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面所述方法制得的诱导性间充质干细胞。
[0007]依据上述实施例的一种制备诱导性间充质干细胞的方法，该方法不需要饲养层细胞和胎牛血清，操作简单，避免了外源基因组整合风险，能够高效稳定地制备出人类iMSCs细胞株。
附图说明
[0008]图1为一种实施例的iMSCs制备流程图。
[0009]图2为实施例1中显微镜下铺板5万/孔细胞在25％左右的汇合度的MSCs图。
[0010]图3为实施例1中的克隆雏形图。
[0011]图4为实施例1中的原代iPSCs图。
[0012]图5为实施例2中的iPSCs图。
[0013]图6为实施例2中的前体iMSC图。
[0014]图7为实施例2中的iMSCs图。
具体实施方式
[0015]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。其中不同实施方式
中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0016]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0017]本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
[0018]根据第一方面，在一实施例中，提供一种制备诱导性间充质干细胞的方法，包括：
[0019]干细胞培养步骤，包括提供间充质干细胞，培养得到诱导性多能干细胞；
[0020]分化步骤，包括将诱导性多能干细胞分化培养为间充质干细胞，即为诱导性多能干细胞(iPSCs)分化来源的间充质干细胞(iMSCs)，亦称诱导性间充质干细胞。
[0021]在一实施例中，干细胞培养步骤中，包括：
[0022]体细胞准备步骤，包括使用无需饲养层细胞、无动物源成分的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞；无需饲养层细胞、无动物源成分的间充质干细胞培养基可以从市场上购买得到；
[0023]细胞转染步骤，包括吸弃间充质干细胞培养基，使用含有细胞因子的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞；
[0024]加药筛选步骤，包括使用含有筛选试剂的间充质干细胞培养基，培养得到筛选后的间充质干细胞；
[0025]去药培养步骤，包括吸弃含有筛选试剂的间充质干细胞培养基，加入去药培养基，培养得到间充质干细胞；
[0026]克隆筛选步骤，包括吸弃去药培养基，加入无需饲养层细胞、无动物源成分的细胞培养基，培养得到间充质干细胞克隆；
[0027]克隆挑取步骤，包括挑取细胞克隆，传代培养，获得诱导性多能干细胞。
[0028]在一实施例中，细胞转染步骤中，所述间充质干细胞培养基中还含有mRNA体外转录混合物(mRNA cocktails)。
[0029]在一实施例中，所述mRNA体外转录混合物包含Oct
‑
3、Oct
‑
4、Klf
‑
4、Sox2、Glis1、c
‑
Myc、嘌呤霉素(puromycin)抗性基因编码序列中的至少一种。
[0030]在一实施例中，细胞转染步骤中，所述细胞因子包括但不限于B18。
[0031]在一实施例中，细胞转染步骤、加药筛选步骤、去药培养步骤中，所述间充质干细胞培养基均为无需饲养层细胞、无动物源成分的间充质干细胞培养基。
[0032]在一实施例中，加药筛选步骤中，所述筛选试剂包括嘌呤霉素。嘌呤霉素的加入旨在筛选去除未成功重编程的细胞。
[0033]在一实施例中，去药培养步骤中，所述去药培养基包括但不限于间充质干细胞培
养基。
[0034]在一实施例中，去药培养步骤中，所述去药培养基中含有细胞因子。
[0035]在一实施例中，去药培养步骤中，所述细胞因子包括但不限于B18。
[0036]在一实施例中，克隆筛选步骤、克隆挑取步骤中，使用的培养基均为无需饲养层细胞、无动物源成分的细胞培养基。
[0037]在一实施例中，克隆筛选步骤中，所述无需饲养层细胞、无动物源成分的细胞培养基包括但不限于mTeSR
TM 1培养基。
[0038]在一实施例中，克隆挑取步骤中，使用的培养基包括但不限于TeSR
TM
‑
E8
TM
培养基。
[0039]在一实施例中，分化步骤中，包括一次分化培养、二次分化培养、三次分化培养。
[0040]在一实施例中，一次分化培养时，使用的一次分化培养基中含有抑制剂。
[0041]在一实施例中，一次分化培养时，所述抑制剂包括但不限于PORCN抑制剂。
[0042]在一实施例中，一次分化培养时，所述PORCN抑制剂包括本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备诱导性间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：干细胞培养步骤，包括提供间充质干细胞，培养得到诱导性多能干细胞；分化步骤，包括将诱导性多能干细胞分化培养为间充质干细胞，即为诱导性间充质干细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，干细胞培养步骤中，包括：体细胞准备步骤，包括使用无需饲养层细胞、无动物源成分的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞；细胞转染步骤，包括吸弃间充质干细胞培养基，使用含有细胞因子的间充质干细胞培养基培养间充质干细胞；加药筛选步骤，包括使用含有筛选试剂的间充质干细胞培养基，培养得到筛选后的间充质干细胞；去药培养步骤，包括吸弃含有筛选试剂的间充质干细胞培养基，加入去药培养基，培养得到间充质干细胞；克隆筛选步骤，包括吸弃去药培养基，加入无需饲养层细胞、无动物源成分的细胞培养基，培养得到间充质干细胞克隆；克隆挑取步骤，包括挑取细胞克隆，传代培养，获得诱导性多能干细胞。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，细胞转染步骤中，所述间充质干细胞培养基中还含有mRNA体外转录混合物；优选地，所述mRNA体外转录混合物包含Oct
‑
3、Oct
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4、Klf
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4、Sox2、Glis1、c
‑
Myc、嘌呤霉素抗性基因编码序列中的至少一种。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，细胞转染步骤中，所述细胞因子包括B18。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，加药筛选步骤中，所述筛选试剂包括嘌呤霉素。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，去药培养步骤中，所述去药培养基包括间充质干细胞培养基；优选地，去...

【专利技术属性】
技术研发人员：王全磊，姜孝明，周光前，常崇斐，彭冬秀，马子玉，马飞龙，甘露，施青，
申请(专利权)人：深圳市乐土生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：