一种抗LAG-3的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种抗LAG

【技术实现步骤摘要】
一种抗LAG
‑
3的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用


[0001]本专利技术属于免疫学
，具体涉及一种抗LAG
‑
3的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用。

技术介绍

[0002]淋巴细胞活化基因
‑
3(Lymphocyte Activation Gene
‑
3，LAG
‑
3)是由LAG
‑
3基因编码的蛋白质/免疫检查点受体，是免疫球蛋白家族中一个重要的负性共刺激分子，表达于细胞毒性T细胞和Treg细胞。LAG
‑
3的主要配体是MHC II类分子，与pMHC II复合物结合后，能够负性调节T细胞的增殖、活化和动态平衡，具有维持内环境稳定和参与免疫调节的功能，与肿瘤的发生发展密切相关。此外，LAG
‑
3表达于聚集在肿瘤病灶的Treg细胞，抑制细胞毒性T细胞。临床前研究显示，阻断LAG
‑
3可以促进T细胞增殖，增强细胞毒性T细胞的功能。
[0003]靶向抑制性协同受体PD
‑
1和CTLA
‑
4的检查点免疫疗法彻底改变了癌症治疗，而LAG
‑
3作为新一代发现的抑制性检查点，有望成为肿瘤治疗中极具前景的靶点。多项研究表明，LAG
‑
3与PD
‑
1协同抑制抗肿瘤免疫和自身免疫。抗LAG
‑
3抗体作为单药治疗的实际疗效或抗LAG
‑
3抗体在PD
‑
1和LAG
‑
3联合治疗中的确切加性效应有待进一步的报道。我国人口基数大，患病人数多，药品需求量大，而拥有自主知识产权的免疫检查点抑制剂药品较少，因此研发拥有自主知识产权的免疫抑制点抑制剂药品尤其重要。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种抗LAG
‑
3的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用，所述纳米抗体和重组纳米抗体能够特异性识别LAG
‑
3抗原，并提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种抗LAG
‑
3的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]本专利技术提供了编码上述纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]本专利技术还提供了一种抗LAG
‑
3的重组纳米抗体，所述重组纳米抗体从N端至C端，依次包括上述纳米抗体和人IgG Fc段。
[0009]优选的，在所述纳米抗体和人IgG Fc段之间还包括连接肽，编码所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0010]优选的，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0011]本专利技术还提供了一种表达上述重组纳米抗体的重组载体，所述重组载体的基础载体包括pET
‑
30a。
[0012]本专利技术还提供了一种表达上述重组纳米抗体的重组菌株，所述重组菌株的基因组
中包含上述重组载体。
[0013]本专利技术还提供了上述纳米抗体、上述重组纳米抗体或上述重组菌株制备得到的重组纳米抗体在制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂中的应用。
[0014]本专利技术还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物的有效成分，包括上述纳米抗体、上述重组纳米抗体或上述重组菌株制备得到的重组纳米抗体。
[0015]本专利技术还提供了一种肿瘤诊断试剂，所述肿瘤诊断试剂的有效成分，包括上述纳米抗体、上述重组纳米抗体或上述重组菌株制备得到的重组纳米抗体。
[0016]有益效果：本专利技术提供了一种抗LAG
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3的纳米抗体，所述纳米抗体来源于骆驼，包括框架区FR和抗原决定簇互补CDR，针对LAG
‑
3的重链。本专利技术基于所述抗LAG
‑
3的纳米抗体，将其与人IgG Fc段连接，形成重组纳米抗体，能够特异性的识别LAG
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3抗原。在本专利技术实施例中，将所述重组纳米抗体与T细胞和Daudi细胞进行共培养，所述重组纳米抗体杀伤肿瘤细胞的最佳浓度为200μg/mL；同时所述重组纳米抗体可促进T/CD19 CAR
‑
T细胞对多种肿瘤细胞的杀伤能力。
附图说明
[0017]图1为纳米抗体的第一轮DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第六道为1000bp的Marker(条带大小依次为：1000、700、500、400、300、200、100bp)，第一、二、三及五道为PCR产物，条带约为700bp，第四道为空；
[0018]图2为纳米抗体的第二轮DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为1000bp的Marker(条带大小同上)，第二、四及六道为PCR产物，条带约为400bp，第三及五道为空；
[0019]图3为用噬菌体的酶联免疫方法(phage
‑
ELISA)筛选特异性单个阳性克隆的模式图：其中1是将LAG
‑
3抗原包被在酶标板上，2是噬菌体上清，3是鼠抗km13107抗体，4是山羊抗鼠IgG(AP)的抗体，5是TMB显色液；
[0020]图4为纯化的重组纳米抗体，其中，左图为破碎后处理样品、流出样品和洗脱样品的SDS
‑
PAGE电泳染色图；右图为纯化后的重组纳米抗体的SDS
‑
PAGE电泳染色图；
[0021]图5为LAG
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3抗原的western blot图；
[0022]图6为不同浓度的重组纳米抗体对Daudi细胞的杀伤能力比较；
[0023]图7为T细胞/CD19 CAR
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T对K562细胞的杀伤；
[0024]图8为T细胞/CD19 CAR
‑
T对Daudi细胞的杀伤。
具体实施方式
[0025]本专利技术提供了一种抗LAG
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3的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：QVQLQESGGGAVQAGGSLRLACALSGFTSRWFTMAWFRQPQGLERMGVASINNEGDTMYAGSFKARFTISHDSAKTTLFLEMNNLKPEDTAMYYCAIQLDPVSAVAAYLVAYFTDYGQGTQVTVSS。
[0026]本专利技术所述纳米抗体优选包括框架区FR和抗原决定簇互补区CDR，其中所述框架区FR优选包括FR1、FR2、FR3和FR4，所述抗原决定簇互补区CDR优选包括CDR1、CDR2和CDR3，对应的氨基酸序列优选如下所示：
[0027]FR1:QVQLQE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗LAG
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3的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.编码权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.一种抗LAG
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3的重组纳米抗体，其特征在于，所述重组纳米抗体从N端至C端，依次包括权利要求1所述纳米抗体和人IgG Fc段。4.根据权利要求3所述重组纳米抗体，其特征在于，在所述纳米抗体和人IgG Fc段之间还包括连接肽，编码所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。5.根据权利要求3或4所述重组纳米抗体，其特征在于，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。6.一种表达权利要求3～5任一项所述重组纳米抗体的重组载体，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐广贤，蒋丹，王红霞，张西倩，舒纬童，蓝华滔，周海金，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：