一种重组非洲猪瘟病毒多表位融合蛋白、制备及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种重组非洲猪瘟病毒多表位融合蛋白、制备及其应用，属于生物技术制药领域，该重组蛋白是将编码非洲猪瘟病毒p72的4个抗原表位和pE248R的N段氨基酸序列的重组表达质粒转入大肠杆菌，经诱导表达和纯化后获得。所述重组非洲猪瘟病毒多抗原表位融合蛋白具有通式：p72抗原表位1

【技术实现步骤摘要】
一种重组非洲猪瘟病毒多表位融合蛋白、制备及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术制药领域，具体涉及一种重组非洲猪瘟病毒多表位融合蛋白、制备及其应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一种猪的急性烈性传染病，死亡率可达100%，目前尚无商品化的疫苗。世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health, OIE）将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列为重点防御的一类动物传染病。
[0003]由于ASFV基因组庞大，编码蛋白众多，病毒结构复杂，至今还没有安全、有效的疫苗用于疫情防控。ASF疫苗以往的研究经验表明：灭活疫苗诱导产生较高水平的体液免疫应答，却不能提供免疫保护；（2）ASF减毒活疫苗接种后虽然能够提供针对同源或异源毒株的免疫保护，但接种的动物易出现不良反应，而且存在毒力返强的风险。（3）一些ASFV抗原亚单位能够诱导产生中和抗体，提供部分免疫保护，该疫苗突出的优点是安全性高，易于鉴别诊断，这为开发安全有效的ASF疫苗提供了可能。随着对ASFV适应性免疫应答、保护性抗原的不断发掘及新型佐剂研究的深入，设计诱导保护性抗体和特异性细胞免疫的有效的ASF亚单位疫苗成为研究的热点领域之一。
[0004]p72是ASFV的重要结构蛋白，是构成病毒粒子衣壳的主要成分，由基因B646L编码，分子量大小为73.2 kDa。p72能够诱导产生中和抗体能抑制ASFV感染宿主细胞。研究表明，这些中和抗体是由p72上一些重要的抗原表位诱导的。另一种值得关注的结构蛋白是pE248R，研究表明，pE248R作为重要是重要的内囊膜蛋白，是诱导产生保护性免疫应答的潜在抗原。

技术实现思路

[0005]为了开发安全有效的ASF疫苗，本专利技术将ASFV结构蛋白p72的4个抗原表位与pE248R的N段氨基酸序列通过连接肽(Linker)串联，获得重组多抗原表位融合蛋白，命名为重组蛋白PPE，含重组蛋白PPE的疫苗在接种小鼠后能诱导产生高水平的抗p72和抗pE248R IgG抗体和特异性细胞免疫，且诱导产生的抗体在体外显著抑制ASFV感染宿主细胞，提示重组蛋白PPE可用于ASF亚单位疫苗的制备。
[0006]本专利技术采用的具体方案如下：本专利技术的目的一是提供一种重组多表位融合蛋白，所述重组多表位融合蛋白由ASFV结构蛋白p72的4个抗原表位和pE248R的N段氨基酸序列通过连接肽(Linker)融合而成，具有以下通式：p72抗原表位1
‑
(Linker)
n
‑
p72抗原表位2
‑
(Linker)
n
‑
p72抗原表位3
‑
(Linker)
n
‑
p72抗原表位4
‑
(Linker)
n
‑
pE248R的N段氨基酸序列；其中，所述p72抗原表位1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述p72抗原表位2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述p72抗原表位3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所
述p72抗原表位4的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述连接肽序列为GGGGS，n为1、2、3或4。
[0007]作为对上述融合蛋白的进一步优化，所述连接肽序列为GGGGS，n为3。
[0008]作为对上述融合蛋白的进一步优化，所述ASFV结构蛋白pE248R的N段的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示。
[0009]作为对上述方案的进一步优化，所述重组多抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。优选地，编码所述重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
[0010]本专利技术的目的二是提供了一种表达载体，所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码上述融合蛋白的核苷酸序列形成；优选地，骨架质粒为pET
‑
30a(+)。
[0011]本专利技术的目的三是提供上述重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1) 载体构建：构建上述的表达载体；(2) 转化及阳性克隆的筛选：将步骤(1)中的表达载体转化至宿主菌，经诱导和SDS
‑
PAGE鉴定得到能够表达目的蛋白的菌株；(3) 诱导表达：将步骤(2)中的阳性菌株转接生长到一定浓度时加入IPTG进行诱导表达；(4) 蛋白纯化：收集步骤(3)中的菌体，经超声破碎、包涵体洗涤及溶解、Ni螯合亲和层析纯化和透析复性得到目的蛋白；（5）重组蛋白的鉴定：采用SDS
‑
PAGE和Western blotting 对(4)中获得的重组蛋白进行鉴定。
[0012]本专利技术的目的四是提供上述重组蛋白在ASF疫苗制备中的应用。
[0013]本专利技术的目的五是提供一种ASF亚单位疫苗，包含上述的融合蛋白。优选地，将所述融合蛋白与ISA 206佐剂配伍后所得的ASF亚单位疫苗效果更佳。
[0014]由于采用了上述技术方案，本专利技术具有如下的优点：1、PPE表达质粒可以在原核表达系统（大肠杆菌）中诱导表达，而且具有表达量高、易于纯化的优点；2、选择pET载体系列时，重组蛋白PPE以融合蛋白形式表达；重组蛋白的C端含有一个分子量仅为0.84 kDa的6
×
His标签，对融合蛋白的功能没有影响，而且使得纯化步骤简单，经一步纯化得到的重组蛋白PPE的纯度在90％以上；3、重组蛋白PPE能够在接种动物体内诱导产生高水平的特异性抗体和细胞免疫。
[0015]4、利用本专利技术制备的重组蛋白PPE可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体。经中和试验证实，所述重组蛋白制备的疫苗诱导产生的抗体在体外能够抑制ASFV感染宿主细胞，具有作为ASF亚单位疫苗的应用的价值。
附图说明
[0016]图1为本专利技术实施列中重组表达载体pET
‑
30a(+)
‑
PPE双酶切鉴定结果。泳道1：pET
‑
30a(+)
‑
PPE NdeI
‑
XhoI双酶切，泳道2：pET
‑
30a(+)
‑
PPE；泳道M： DNA分子量标准(Marker)；图2为本专利技术实施列中重组蛋白PPE诱导表达及纯化的SDS
‑
PAGE检测结果。泳道1：阳性菌株诱导前；泳道2：蛋白分子量标准（Marker）；泳道3：阳性菌株诱导后；泳道4：菌体破
碎后沉淀；泳道5：包涵体溶解；泳道6：纯化的PPE；图3为本专利技术实施列中利用6*His单克隆抗体(A)和ASFV阳性血清(B)对重组蛋白PPE进行鉴定的Western blotting结果。泳道1：牛血清白蛋白；泳道2：纯化的PPE；泳道M：蛋白分子量本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组多表位融合蛋白，所述重组多表位融合蛋白由ASFV结构蛋白p72的4个抗原表位和pE248R的N段氨基酸序列通过连接肽(Linker)融合而成，具有以下通式：p72抗原表位1
‑
(Linker)
n
‑
p72抗原表位2
‑
(Linker)
n
‑
p72抗原表位3
‑
(Linker)
n
‑
p72抗原表位4
‑
(Linker)
n
‑
pE248R 的N段氨基酸序列；其中，所述p72抗原表位1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述p72抗原表位2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述p72抗原表位3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述p72抗原表位4的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述连接肽序列为GGGGS，n为1、2、3或4。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述连接肽序列为GGGGS，n为3。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述ASFV结构蛋白pE248R的N段的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于：所述重...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵军军，张光磊，刘伟，杨思成，常惠芸，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：