纯化噬菌体粒子的方法技术

本发明专利技术公开了一种从例如粗噬菌体制备物、例如由在细菌细胞培养物中扩增噬菌体而产生的裂解物回收活噬菌体的方法。所述方法可能是“通用的”；也就是说，适用于广范围的噬菌体种和株的纯化。从所述方法得到的噬菌体产物可能具有可接受的低内毒素滴度(例如低于500EU/ml)和足够高的噬菌体滴度(例如>1x 109PFU/ml)，以用于治疗性应用。以用于治疗性应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纯化噬菌体粒子的方法


[0001]本专利技术涉及一种从例如粗噬菌体制备物、例如由在细菌细胞培养物中扩增噬菌体而产生的裂解物回收活噬菌体的方法。所述方法可能是“通用的”；也就是说，适用于广范围的噬菌体种和株的纯化。

技术介绍

[0002]在下面的讨论中，出于背景和介绍的目的将描述某些文章和方法。本文包含的任何内容均不应被解释为对现有技术的“承认”。本申请人明确地保留在适当情况下证明本文引用的文章和方法在适用法律规定下不构成现有技术的权利。
[0003]多重耐药(MDR)细菌正以惊人的速度出现。目前，据估计，美国每年至少有200万例由MDR生物体引起的感染，导致大约23,000人死亡。此外，据信遗传工程和合成生物学也可能导致产生额外的高毒力微生物。
[0004]例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是可引起皮肤和软组织感染(SSTI)、肺炎、坏死性筋膜炎和血流感染(即菌血症)的革兰氏阳性细菌。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(“MRSA”)是一种在临床背景中备受关注的MDR生物体，因为MRSA造成超过80,000例侵袭性感染，接近12,000例相关死亡，并且是医院获得性感染的主要原因。此外，世界卫生组织(WHO)已将MRSA确定为国际关注的生物体。
[0005]有鉴于快速出现和蔓延的毒性微生物和抗微生物剂耐药性的潜在威胁，正在开发针对细菌感染的可替代临床治疗方法。MDR感染的一种此类潜在治疗方法涉及使用噬菌体。噬菌体是一组多样化的病毒，其在特定细菌宿主内复制并可杀死它们。在20世纪初首次分离到噬菌体后，人们研究了利用噬菌体作为抗细菌剂的可能性，并在某些国家将它们作为抗细菌剂临床使用，取得了一些成功。尽管如此，在发现青霉素后，美国基本上放弃了噬菌体疗法，直到最近才重新对基于噬菌体的疗法产生兴趣。
[0006]噬菌体的成功治疗性应用依赖于噬菌体组合物的可行生产方法，所述组合物适合于给药到患者(例如患有MDR细菌病原体感染的患者)，因此必需具有高噬菌体滴度(即高噬菌体含量)。以如此大的量生产噬菌体(例如“扩增”)用于治疗性应用需要在细菌宿主细胞培养物中生长。然而，这意味着从培养物获得的噬菌体裂解物含有与在打算用于治疗性用途的组合物中使用不相容的宿主细胞物质(例如宿主细胞蛋白(HCP)、细胞壁物质和残留DNA(rDNA))。具体来说，在革兰氏阴性细菌(例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)宿主细胞)的情况下，所述宿主细胞壁物质包括内毒素(也被称为脂多糖(LPS)和脂聚糖)，它们可以在患者中引起显著毒性和疾病，因此必须基本上从治疗组合物中去除(例如达到低于500或1000EU/ml的水平)。也就是说，噬菌体必须经过一定程序以产生已被充分纯化或以其他方式“清除”宿主细胞物质和其他污染物的“噬菌体产物”，使得它可以作为治疗组合物使用或适合于作为治疗组合物使用。
[0007]以前，噬菌体的纯化通过离子交换层析和/或在氯化铯(CsCl)梯度上的等密度离心来进行。离子交换层析在生物分子对离子交换树脂的亲和性的基础上促进生物分子(例
如噬菌体)的分离(Andriaenssens EM等，Virology 434(2):265
‑
270,2012)。尽管这个程序对带电荷的蛋白质来说工作良好，但每种独特的噬菌体都需要对捕获和洗脱噬菌体所需的层析条件进行优化。因此，考虑到优化每个噬菌体种和株的条件所需的工作量，并且这还可能因来自于噬菌体扩增阶段的缓冲液/生长培养基条件的批次间波动而被进一步复杂化，这种纯化方法对于商业化生产治疗性噬菌体组合物来说变得繁琐。另一方面，在CsCl密度梯度上的等密度离心不需要解决此类困难，但耗时、不容易规模放大并带来其他问题。例如，内毒素和HCP可以与噬菌体结合，产生多个噬菌体条带和滴度的损失。本申请人还观察到某些噬菌体种和株不能在该纯化过程中存活。
[0008]因此，对开发用于回收或制备旨在用于噬菌体疗法的噬菌体的可行的替代程序，存在着需求。优选情况下，此类程序是“通用的”；也就是说，适用于广范围的噬菌体种和株的纯化。此外，替代程序优选地适用于能够以相对快速的方式处理大量体积的回收系统，例如连续或单一过程过滤型系统，包括切向流过滤(TFF)系统(也被称为交叉流过滤)。

技术实现思路

[0009]提供本概述是为了以简化形式介绍一些将在下面的详细描述中进一步描述的概念。本概述不打算鉴定要求保护的主题内容的关键或基本特征，也不打算用于限制要求保护的主题内容的范围。要求保护的主题内容的其他特征、细节、效用和优点将从下述书面详细描述、包括在任何附图中示出并在权利要求书中定义的那些方面而变得显而易见。
[0010]本申请人寻求鉴定和开发一种噬菌体回收方法，所述方法有利地受益于噬菌体相对有限的粒度范围(即大多数种和株的噬菌体粒子的尺寸范围为24至200nm长)，并因此可能支持一种可能是通用的或至少适用于纯化显著量的具有治疗意义的噬菌体的纯化方法。因此，本专利技术的方法采用选择性过滤来保留噬菌体粒子，同时能够使不想要的物质例如内毒素、HCP和残留的宿主细胞DNA通过滤器自由清洗，以便可以将它们去除。然而，这依赖于鉴定一种将不想要的物质(即污染物)与噬菌体粒子解离并分解(解聚集)不想要的物质(特别是已知通过其疏水性脂质区形成大的聚集体(胶束)的内毒素)的任何大的聚集体，而不会对噬菌体造成实质性损害或变性(即使得活噬菌体的损失很小或没有损失)的过程。如下文所述并在实施例中举例说明的，本申请人确实已经鉴定了一种能够在培养物中大规模噬菌体扩增后可靠地从宿主细胞物质(特别是内毒素)回收噬菌体的噬菌体回收方法，所述方法迄今为止在所有测试的噬菌体种和株中都取得了成功。
[0011]本专利技术涉及一种从粗噬菌体制备物回收活噬菌体的方法，其中所述方法包括下述步骤：
[0012]1)将所述粗噬菌体制备物添加到包含尺寸排阻滤器的主动过滤系统，其中所述滤器的孔径小于所述粗噬菌体制备物中包含的噬菌体的尺寸；
[0013]2)将一系列缓冲液通过所述滤器，其中所述一系列缓冲液包括：
[0014]a)破坏离子蛋白质相互作用的缓冲液；
[0015]b)破坏疏水/亲水相互作用的缓冲液；和
[0016]c)沉淀噬菌体的缓冲液；并且
[0017]3)从所述滤器回收所述噬菌体，其中回收的噬菌体是活的。
[0018]所述方法适合于在主动过滤系统例如连续过滤系统(例如TFF)中进行。
[0019]从本专利技术的方法得到的“噬菌体产物”可能具有可接受的低内毒素滴度(例如小于500EU/ml)和高噬菌体滴度(例如大于1x109PFU/ml)，以用于治疗性应用。所述噬菌体产物可能适用于制备包含噬菌体的组合物，以用于治疗细菌感染的噬菌体疗法。
[0020]因此，本专利技术还涉及根据本专利技术的方法制备的噬菌体产物。
[0021]此外，本专利技术涉及一种治疗性组合物，其包含任选地与一种或多种可药用赋形剂、载体、缓冲液和/或稀释剂组合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从粗噬菌体制备物回收活噬菌体的方法，其中所述方法包括下述步骤：a)将所述粗噬菌体制备物添加到包含尺寸排阻滤器的主动过滤系统，其中所述滤器的孔径小于所述粗噬菌体制备物中包含的噬菌体的尺寸；b)将一系列缓冲液通过所述滤器，其中所述一系列缓冲液包括：a)破坏离子蛋白质相互作用的缓冲液；b)破坏疏水/亲水相互作用的缓冲液；和c)沉淀噬菌体的缓冲液；并且c)从所述滤器回收所述噬菌体，其中所述回收的噬菌体是活的。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述孔径允许尺寸小于100Kda、小于150Kda、小于200Kda、小于250Kda、小于300Kda、小于350kDa、小于400kDa、小于450KDa、小于500kDa、小于550kDa、小于600kDa、小于650kDa、小于700kDa、小于750kDa或小于800kDa的物质通过。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述尺寸排阻滤器是中空纤维滤器。4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中：(a)所述破坏离子蛋白质相互作用的缓冲液包含高离子强度缓冲液；(b)所述破坏疏水/亲水相互作用的缓冲液包含去污剂和/或非变性有机溶剂；并且(c)所述沉淀噬菌体的缓冲液是硫酸铵缓冲液。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述高离子强度缓冲液包含至少250mM、至少300mM、至少350mM、至少400mM、至少450mM、至少500mM、至少550mM、至少600mM、至少650mM、至少700mM、至少750mM、至少800mM、至少850mM、至少900mM或至少950mM或1M的盐。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述盐是NaCl和/或MgCl。7.根据权利要求4所述的方法，其中所述去污剂包括非离子型表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。8.根据权利要求4所述的方法，其中所述破坏疏水/亲水相互作用的缓冲液包含：(i)Triton X
‑
100；(ii)Triton X
‑
100和第二去污剂；(iii)Triton X
‑
100和高离子强度溶液；(iv)Triton X
‑
100和离液剂；或(v)离液剂。9.根据权利要求4所述的方法，其中所述破坏疏水/亲水相互作用的缓冲液包含：(i)两性离子表面活性剂和高离子强度溶液；或(ii)两性离子表面活性剂和离液剂。10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述方法在步骤2)中将缓冲液a)、b)和c)中的任一者或全部通过所述滤器之间还包括一个或多个清洗步骤。11.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中在步骤2)中将缓冲液a)、b)和c)以任何顺序通过所述滤器。12.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述主动过滤系统是切向流过滤(TFF)系统。13.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述方法在1
‑
3000秒
‑1、2000
‑
4000秒
‑1、3000
‑
5000秒
‑1、4000
‑
6000秒
‑1、6000
‑
8000秒
‑1、1000
‑
4000秒
‑1、2000
‑
5000秒
‑1、3000
‑
6000秒
‑1、4000
‑
7000秒
‑1、5000
‑
8000秒
‑1、1000
‑
6000秒
‑1、2000
‑
6000秒
‑1、3000
‑
6000秒
‑1、4000
‑
6000秒
‑1、5000
‑
7000秒
‑1、6000
‑
8000秒
‑1范围内、小于2000...

【专利技术属性】
技术研发人员：约瑟夫，
申请(专利权)人：自适应噬菌体治疗公司，
类型：发明
国别省市：