一种检测肝豆状核变性基因高频突变的引物组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种检测肝豆状核变性基因高频突变的引物组合及试剂盒，涉及基因检测技术领域。本发明专利技术选取ATP7B基因的p.R778L，p.P992L和p.T935M三个高频突变位点，根据四引物扩增受阻体系，针对每个检测位点分别设置四条引物，其中两条为延伸方向相反的内引物，两条内引物的3

【技术实现步骤摘要】
一种检测肝豆状核变性基因高频突变的引物组合及试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因检测
，特别涉及检测肝豆状核变性基因高频突变的引物组合及试剂盒。

技术介绍

[0002]肝豆状核变性又称Wilson病，是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体单基因隐性遗传疾病，病变主要累及肝脏、脑、肾脏和角膜等部位，引起进行性加重的肝硬化、基底节损害、肾脏损害及角膜色素环等。肝豆状核变性由ATP7B基因突变引起，该基因编码铜转运P型ATP酶(copper
‑
transporting P
‑
type ATPase， ATP7B)。ATP7B基因突变以高频突变伴随广泛存在的罕见突变为特征，具有明显的地域及种族分布特征。ATP7B是一种表达在多器官的膜蛋白，主要功能是促进铜随血液及胆汁排泄。当ATP7B基因发生突变时，ATP7B在细胞内的定位发生改变，其转运铜能力下降，引起血清铜蓝蛋白合成减少、胆管排铜受阻。过量的铜蓄积在体内，引起细胞坏死和器官损害，后期严重影响患者的生活质量，最终可引起死亡。目前，肝豆状核变性的诊断主要依靠典型的临床表现、实验室检查及基因检测，治疗包括青霉胺、锌制剂和肝移植等。早期诊断和早期干预对于延缓疾病的进展和预防不可逆的后遗症至关重要。
[0003]目前，国内外用于SNP基因突变的检测方法主要有：聚合酶链反应 (PCR)分析技术、变性高效液相色谱(DHPLC)分析技术、DNA测序技术、DNA微阵列技术、高分辨率溶解曲线分析(HRM)、Taqman探针技术等。多重扩增阻滞突变系统PCR(multiplex amplification refractory mutationsystem PCR，M
‑
ARMS
‑
PCR)是聚合酶链反应分析技术的一种，ARMS自 1989年问世以来已被用来检测多种基因的已知点突变，其原理是PCR扩增时引物是否能延伸主要取决于引物3
’
端的1～2个碱基是否与模板配对，如果不配对则引物不能延伸，故只要能设计适当的引物，则可以区别正常和突变的DNA序列。在ARMS基础上设计多重PCR，可同时检测多种突变。目前，已有将ARMS技术应用于肝豆状核变性的突变基因检测中，但检测位点、准确度、重复性、灵敏度等尚有待进一步探讨，无法满足临床的应用。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术目的在于提供一种检测肝豆状核变性基因高频突变的引物组合及试剂盒，本专利技术提供的引物组合及试剂盒能同时检测三个SNP位点，检测成本低，周期短，操作简单，准确度高，具有较好的特异性，能够满足临床的应用。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]一种检测肝豆状核变性基因高频突变的引物组合，包括第一引物组、第二引物组和第三引物组；
[0007]所述第一引物组由第一正常外引物、第一正常内引物、第一突变内引物和第一突变外引物组成，所述第一正常外引物、第一正常内引物、第一突变内引物和第一突变外引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4 所示；所述第一引物组用于检测ATP7B基
因的p.R778L位点；
[0008]所述第二引物组由第二正常外引物、第二正常内引物、第二突变内引物和第二突变外引物组成；所述第二正常外引物、第二正常内引物、第二突变内引物和第二突变外引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8 所示；所述第二引物组用于检测ATP7B基因p.P992L位点；
[0009]所述第三引物组由第三正常外引物、第三正常内引物、第三突变内引物和第三突变外引物组成；所述第三正常外引物、第三正常内引物、第三突变内引物和第三突变外引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12 所示；所述第三引物组用于检测ATP7B基因p.T935M位点。
[0010]优选地，所述第一引物组、第二引物组和第三引物组中每条引物的Tm 值独立地为58～62℃。
[0011]优选地，所述第一正常外引物、第二正常外引物、第三正常外引物的5
’
端标记有荧光素，所述荧光素为FAM、HEX、TAMRE，其中，FAM标记 p.R778L位点、HEX标记p.P992L位点、TAMRE标记p.T935M位点。
[0012]优选地，所述第一突变内引物、第二突变内引物、第三突变内引物的3
’
末端的
‑
3位引入错配碱基。
[0013]本专利技术还提供了一种用于检测肝豆状核变性基因高频突变的试剂盒，包括权利要求1～4任意一项所述的引物组合。
[0014]优选地，还包括ROX
‑
500分子量内标。
[0015]优选地，所述试剂盒包括：
[0016][0017]优选地，所述2
×
Buffer Mix包括：1.5mM硫酸铵、1.5mM镁离子、0.2 mM dNTPs、20mM氯化钾、0.3mg/ml BSA、6％DMSO、50mM甜菜碱、 35nM Tris
‑
HCL、0.8U Taq DNA聚合酶、0.2U UNG酶。
[0018]优选地，所述引物Mix中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4的浓度均为0.052 μM，SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8的浓度均为0.163μM，SEQ ID NO.9～SEQID NO.12的浓度均为0.468μM。
[0019]优选地，所述试剂盒用于PCR扩增，所述PCR的反应条件为：50℃孵育5min；98℃变性3min；94℃变性10S，62℃退火30S，28个循环；72℃延伸5min。
[0020]有益技术效果：本专利技术选取了ATP7B基因的p.R778L，p.P992L和 p.T935M三个高频突变位点，根据四引物扩增受阻体系，针对每个检测位点分别设置四条引物，其中两条为延伸方向相反的内引物，两条内引物的3
’
末端碱基分别与其所检测的SNP位点的一个碱基相同(或互补)，另外两条为两条延伸方向相反的外引物。每个检测位点的四条引物均可以组成三个引物对，三个检测位点的全部12条引物在同一个扩增体系内进行反应，扩增产物用毛细管电泳进行检测，检测结果用GeneMapper ID
‑
X分析，判读结果。本专利技术提供的引物组
合及试剂盒能同时检测三个SNP位点，检测成本低，周期短，操作简单，准确度高，检测结果易判读，特异性高，实用性强。
附图说明
[0021]图1为ROX
‑
500分子量内标的毛细管电泳图；
[0022]图2为1F1、1R1
‑
1、1F2
‑
2、1R2引物组合对p.R778L突变型质粒的检测图；
[0023]图3为1F1、1R1
‑
1、1F2
‑
1、1R2引物组合扩本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测肝豆状核变性基因高频突变的引物组合，其特征在于，包括第一引物组、第二引物组和第三引物组；所述第一引物组由第一正常外引物、第一正常内引物、第一突变内引物和第一突变外引物组成，所述第一正常外引物、第一正常内引物、第一突变内引物和第一突变外引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示；所述第一引物组用于检测ATP7B基因的p.R778L位点；所述第二引物组由第二正常外引物、第二正常内引物、第二突变内引物和第二突变外引物组成；所述第二正常外引物、第二正常内引物、第二突变内引物和第二突变外引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示；所述第二引物组用于检测ATP7B基因p.P992L位点；所述第三引物组由第三正常外引物、第三正常内引物、第三突变内引物和第三突变外引物组成；所述第三正常外引物、第三正常内引物、第三突变内引物和第三突变外引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示；所述第三引物组用于检测ATP7B基因p.T935M位点。2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述第一引物组、第二引物组和第三引物组中的每条引物的Tm值独立地为58～62℃。3.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述第一正常外引物、第二正常外引物、第三正常外引物的5
’
端标记有荧光素，所述荧光素为FAM、HEX、TAMRE，其中，FAM标记p.R778L位点、HEX标记p.P992L位点、TAMRE标记p.T9...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴志英，董毅，杨寒霖，金芬芬，马越，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：