与抗甲状腺药物引起的粒细胞缺乏相关的MUC22基因突变位点及其应用制造技术

本发明专利技术公开了与抗甲状腺药物引起的粒细胞缺乏相关的MUC22基因突变位点及其应用。本发明专利技术提供了序列如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的特异性核酸引物，可以以人基因组DNA为模板扩增MUC22基因片段，该片段中所含位点rs1385372181的序列为TIA易感性鉴定、早期诊断以及探索新的TIA预防和治疗靶点提供了有效的分子标记。的分子标记。

【技术实现步骤摘要】
与抗甲状腺药物引起的粒细胞缺乏相关的MUC22基因突变位点及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及位点rs1385372181在检测抗甲状腺药物引起的粒细胞缺乏症(Antithyroid drug
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induced agranulocytosis，TIA)易感性中的应用。

技术介绍

[0002]甲状腺机能亢进症(Hyperthyroidism)是一组以甲状腺激素异常分泌增多为特征的器官特异性自身免疫性疾病。Graves病(GD)是引起甲状腺机能亢进症(简称甲亢)的最常见原因，约占甲亢总人数的80％～85％。Graves病的主要临床表现为高代谢症候群、眼球突出、胫前粘液性水肿等，可累及全身多个系统。目前针对Graves病的治疗方法主要有三种：抗甲状腺药物(Antithyroid drug,ATD)、放射碘治疗131I及手术治疗。抗甲状腺药物主要通过抑制体内过氧化物酶系统、阻断碘的活化，从而减少甲状腺激素的合成，是目前治疗Graves病的首选方案。ATD包括甲巯咪唑(methimazole,MMI)和丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil,PTU)，其中甲巯咪唑是临床主要应用药物。
[0003]ATD治疗甲亢的疗效肯定，但用药过程中会出现包括皮肤瘙痒或者皮疹、关节肌肉疼痛和发热在内的副作用，其发生率约为5％。患者大多症状轻微，对症处理或停药后一般很快就缓解。而严重的不良反应包括药物性肝损害、中性粒细胞胞质抗体阳性的血管炎、粒细胞缺乏(简称粒缺)，发生率约为0.1％～0.5％。粒细胞缺乏症是服用ATD后最严重的不良反应之一，通常是指外周血中性粒细胞的绝对值低于0.5
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109/l。虽然TIA的发病在接受ATD治疗的患者中只占0.1％～0.3％，但通常病情进展迅速，极易并发消化系统、呼吸系统、泌尿系统等多系统的感染，严重的患者还会继发脓毒血症或败血症，甚至诱发甲状腺危象，因而TIA的病死率较高。目前，临床上仍缺乏对ATD所致粒细胞缺乏症发病的预测及预防机制，导致其延迟诊治的情况非常普遍，而延迟诊治会延长粒细胞缺乏症的恢复时间，甚至增加死亡风险。
[0004]近年来国内外学者对TIA的发病机制进行了大量的研究，涉及到遗传易感性、免疫抑制、药物对骨髓毒性作用以及过敏因素等，虽然TIA的发病机制目前尚不明确，但免疫遗传因素与之密切相关的观点已得到了共识，即认为ATD作为一种半抗原，与体内特异蛋白结合刺激机体产生抗体，该抗体可与白细胞表面的抗原特异性结合，产生自身免疫破坏，从而导致粒细胞破坏。
[0005]人类主要组织相容性抗原(Major Histocompatibility Complex,MHC)系统是目前已知的人类染色体中结构最为复杂的区域，具有丰富的遗传多态性和高度的连锁不平衡。MHC区域位于6号染色体短臂6p21.31内，由一群密切连锁的基因组成，这些基因与多种药物不良反应的遗传易感相关。例如日本学者Tamai等研究发现人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)HLA
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DRB1＊08032等位基因与MMI导致粒细胞减少症之间存在明显的相关性；学者Chen等人报道了当地人群抗甲状腺药物所致粒细胞缺乏症的相关易感基因HLA
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B＊38:02和HLA
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DRB1＊08:03。这些结果均证实MHC区域基因及相关位点与抗甲状腺
药物所致粒细胞缺乏症的发生之间存在相关性，而且在不同地区及种族，与抗甲状腺药物所致粒细胞缺乏症相关的基因位点存在差异。但这些研究仅是通过对已知与免疫反应有关的基因进行筛选研究得出的结论，还不能以此预测TIA的易患人群。TIA通常出现于用药后的2～3个月内，个别病例在用药的后期发生，也可见于全程中的任何时间，各研究中心的临床数据也提示由于部分TIA突然起病，即使进行了规律的血常规监测并不能早期发现所有的患者，因而亟待寻找用于有效预测TIA发生的临床生物标记，从而实现TIA易感人群的检测。
[0006]随后基因组的计划不断向前发展，TIA相关的药物基因组学研究快速发展，而且不断有研究报道新的候选基因。从目前的研究来看，尽管TIA的易感基因多位于6号染色体的MHC区域，但针对MHC区域的深度测序和基因分型尚未能发现可用于TIA的早期诊断、基因治疗靶点定位的有效依据。
[0007]定位于人染色体6p21.33位置的MUC22基因编码一种跨膜粘蛋白，目前尚未见到MUC22基因突变与TIA相关的报道。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供与抗甲状腺药物引起的粒细胞缺乏相关的MUC22基因突变位点及其应用。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0010]一种检测人MUC22基因InDel位点rs1385372181多态性的方法，包括以下步骤：
[0011]1)利用特异性核酸引物扩增个体离体样本中包含有MUC22基因InDel位点rs1385372181的DNA片段，得扩增产物；所述特异性核酸引物的序列如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示(根据rs1385372181设计的上游引物和下游引物)；
[0012]2)将扩增产物进行3％琼脂糖凝胶电泳检测或进行测序，根据电泳检测或测序结果确定个体MUC22基因InDel位点rs1385372181的基因型。
[0013]优选的，所述步骤1中，离体样本选自体液(例如血液、腹水、尿液)、组织细胞(例如肝组织、皮肤组织，肌肉组织)或毛发等。通过提取和纯化这些样本可制备个体的基因组DNA，从而以来源于人的基因组DNA为模板，利用上述特异性核酸引物并通过PCR反应获得上述扩增产物。
[0014]优选的，所述步骤1中，扩增条件包括：95℃5～10min；94℃0.5min，60℃0.75min，72℃1min，30个循环；72℃5min。
[0015]优选的，所述步骤1中，PCR反应体系包括1～2μl模板DNA以及10μM上、下游引物各2μl。
[0016]优选的，所述步骤1中，DNA片段的参考序列如SEQ.ID.NO.1所示，在该核苷酸序列的第95位之后存在一个16bp插入/缺失多态性位点(InDel位点)，即rs1385372181，该位点位于MUC22基因内含子区域，具体位于人类参考基因组11号染色体第31012785到31012800位，在GD人群(包括TIA患者，还包括在采用ATD治疗中和治疗后未出现粒细胞缺乏症的GD对照)中存在该位点发生缺失突变(等位基因上缺失的基因片段为CGCCGTCTCACCCTCC)的个体。
[0017]优选的，所述步骤2中，当扩增产物的电泳检测结果显示存在长度为219bp的条带，
10μl，上下转动混匀至液体变粘稠。56℃水浴过夜裂解细胞、消化蛋白，保温过程中，不时上下转动几次，混匀反应液。
[0033]1.3第二天，反应液冷却至室温后加入等体积的饱和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测MUC22基因InDel位点rs1385372181多态性的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)利用特异性核酸引物扩增个体离体样本中包含有MUC22基因InDel位点rs1385372181的DNA片段，得扩增产物；所述特异性核酸引物的序列如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示；2)将扩增产物进行电泳检测或进行测序，根据电泳检测或测序结果确定个体MUC22基因InDel位点rs1385372181的基因型。2.根据权利要求1所述一种检测MUC22基因InDel位点rs1385372181多态性的方法，其特征在于：所述步骤1中，离体样本选自体液、组织细胞或毛发。3.根据权利要求1所述一种检测MUC22基因InDel位点rs1385372181多态性的方法，其特征在于：所述步骤1中，扩增条件包括：95℃5～10min；94℃0.5min，60℃0.75min，72℃1min，30个循环；72℃5min。4.根据权利要求1所述一种检测MUC22基因InDel位点rs1385372181多态性的方法，其特征在于：所述步骤1中，扩增采用的PCR反应体系包括1～2μl模板DNA以及10μM上、下游引物各2μl。5.根据权利要求1所述一种检测MUC22基因InDel位点rs1385372181多态性的方法，其特征在于：所述步骤1中，DNA片段的...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺雅毅，马盼，郭辉，张宝，
申请(专利权)人：西安交通大学医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：