一种检测NK细胞活性的方法技术

本发明专利技术一种检测NK细胞活性的方法，包括如下步骤：制备靶细胞、制备效应细胞悬液、制备靶细胞悬液、效应细胞悬液和靶细胞悬液混合培养、将培养后的细胞混悬液离心、进行Annexin V

【技术实现步骤摘要】
一种检测NK细胞活性的方法


[0001]本专利技术涉及细胞检测
，具体涉及一种检测NK细胞活性 的方法。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞， 不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与 超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。它 对体内多种细胞，特别是T、B淋巴细胞有调节作用。它所介导的裂 解细胞作用不受主要组织相溶性复合体的限制。自然杀伤细胞不仅对 癌细胞，对病毒、胞内寄生菌和老化变异细胞也具有极强的清除作用。 NK细胞起杀伤作用不需要预先免疫或致敏，杀伤作用早于其它效应 细胞，是机体抗肿瘤的第一道防线。NK细胞在抗病毒及自身免疫性 疾病的发病机理中起着一定作用，在抗肿瘤及免疫调节方面有重要意 义。因此，发现增强NK细胞活性化合物，对免疫调节、抗肿瘤方面 有重要的意义。
[0003]受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，可 判定该项试验结果阳性。活性升高，常见于病毒感染的早期，Down 综合征，接受器官移植、骨髓移植的患者等及免疫增强剂治疗患者。 活性降低，常见于恶性肿瘤、重症联合免疫缺陷病，AIDS和免疫抑 制剂治疗者等。需要检查的人群一般为接受器官移植、骨髓移植的患 者等及免疫增强剂治疗患者，免疫力低下者也可检查。
[0004]传统检测NK细胞活性的方法通常为Cr释放法、乳酸脱氢酶 (LDH)释放法和四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法等。其中Cr释放 法准确性较高，常被作为金标准，但因设备价格昂贵且存在放射污染， 目前已不常使用。LDH释放法、MT比色法准确性及稳定性相对较差。 流式细胞术为基础的NK细胞活性的测定方法，易出现非特异性染色， 且可能对效、靶细胞的功能及杀伤易感性造成影响；另有通过基因转 染方法使靶细胞特异性表达EGFP，再使用碘化丙啶(PI)标记死亡 细胞进行测定，但多为瞬时转染，细胞传代后会出现EGFP丢失， 且PI仅能标记晚期凋亡及坏死细胞，无法反映NK细胞对靶细胞杀 伤的早期凋亡比例。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种检测NK细胞活性的方 法，既省去了预先细胞染色或抗体标记的过程，又可保证检测方法的 长期可持续性及结果的可靠性。
[0007](二)技术方案
[0008]一种检测NK细胞活性的方法，包括如下步骤：
[0009]一种检测NK细胞活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0010](1)制备靶细胞：建立增强型绿色荧光蛋白(EGFP)
‑
K562稳 定细胞株；
[0011](2)取血样，全血滤除白细胞后，取适量慢慢移入到离心管中， 离心管中装有淋巴细胞分离液，用密度梯度离心法进行离心，得到分 层液；
[0012](3)制备效应细胞悬液：将步骤(2)得到的分层液中间白膜层 吸出，获得外周血单
个核细胞(PBMC)，PBS洗涤两次，倒掉上清 液，用培养液Ⅰ将外周血单个核细胞密度调至一定浓度备用；
[0013](4)制备靶细胞悬液：将步骤(1)培养的(EGFP)
‑
K562稳 定细胞株用PBS洗涤，用培养液Ⅱ将细胞密度调至一定浓度备用；
[0014](5)取步骤(3)和步骤(4)制得的效应细胞(PBMC)悬液 和靶细胞(EGFP
‑
K562细胞)悬液以体积比为1:1的量加入EP管中 混匀，置培养箱培养一段时间；
[0015](5)将培养后的细胞混悬液收集于流式检测管中，微量离心机 离心，弃培养液，进行Annexin V
‑
PE/7AAD染色标记后，上流式细 胞仪检测。
[0016]进一步地，步骤(1)通过慢病毒转染技术构建稳定表达EGFP 的K562细胞系。
[0017]进一步地，步骤(2)中离心机设置700g、22℃下离心15min。
[0018]进一步地，步骤(3)培养液Ⅰ为含10％胎牛血清的RPMI
‑
K562 培养液，培养液Ⅰ将细胞密度调至1～2
×
106/ml备用。
[0019]进一步地，步骤(4)培养液Ⅱ为RPMI1640培养液，培养液
Ⅱꢀ
将细胞密度调至1～2
×
105/ml备用。
[0020]进一步地，步骤(4)(EGFP)
‑
K562稳定细胞株用PBS洗涤后， 用锥虫蓝检测细胞成活率在90％以上后，再加入培养液Ⅱ。
[0021]进一步地，步骤(5)培养箱设置37℃、5％CO2，共培养4小时。
[0022](三)有益效果
[0023]本专利技术的目的在于克服现有技术中的上述问题，提供一种检测 NK细胞活性的方法。
[0024]本专利技术采用慢病毒介导的细胞稳定转染，构建稳定表达EGFP的 靶细胞株，既省去了预先细胞染色或抗体标记的过程，又可保证检测 方法的长期可持续性及结果的可靠性。采用Annexin V
‑
PE/7AAD双 染色标记细胞凋亡，可明确区分经NK细胞杀伤作用后靶细胞各阶段 不同状态(活细胞、早期凋亡、晚期凋亡及坏死细胞)所占比例，构 成完整的细胞凋亡数据。本方法与传统检测方法相比，省去了设效应 细胞的自然释放孔，因而检测所需获取的效应细胞数量减少，相应采 血量减少。
具体实施方式
[0025]下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。 基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动 前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]实施例1：
[0027]一种检测NK细胞活性的方法，包括如下步骤：
[0028](1)制备靶细胞：慢病毒转染技术构建稳定表达EGFP的K562 细胞系；
[0029](2)取血样，全血滤除白细胞后，取适量慢慢移入到离心管中， 离心管中装有淋巴细胞分离液，离心机设置700g、22℃下离心 15min，得到分层液；
[0030](3)制备效应细胞悬液：将步骤(2)得到的分层液中间白膜层 吸出，获得外周血单个核细胞(PBMC)，PBS洗涤两次，倒掉上清 液，用含10％胎牛血清的RPMI
‑
K562培养液将细
胞密度调至1
×ꢀ
106/ml备用；
[0031](4)制备靶细胞悬液：将步骤(1)培养的(EGFP)
‑
K562稳 定细胞株用PBS洗涤，用锥虫蓝检测细胞成活率在90％以上后，用 RPMI1640培养液将细胞密度调至1
×
105/ml备用；
[0032](5)取步骤(3)和步骤(4)制得的效应细胞(PBMC)悬液 和靶细胞(EGFP
‑
K562细胞)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测NK细胞活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备靶细胞：建立增强型绿色荧光蛋白(EGFP)
‑
K562稳定细胞株；(2)取血样，全血滤除白细胞后，取适量慢慢移入到离心管中，离心管中装有淋巴细胞分离液，用密度梯度离心法进行离心，得到分层液；(3)制备效应细胞悬液：将步骤(2)得到的分层液中间白膜层吸出，获得外周血单个核细胞(PBMC)，PBS洗涤两次，倒掉上清液，用培养液Ⅰ将外周血单个核细胞密度调至一定浓度备用；(4)制备靶细胞悬液：将步骤(1)培养的(EGFP)
‑
K562稳定细胞株用PBS洗涤，用培养液Ⅱ将细胞密度调至一定浓度备用；(5)取步骤(3)和步骤(4)制得的效应细胞(PBMC)悬液和靶细胞(EGFP
‑
K562细胞)悬液以体积比为1:1的量加入EP管中混匀，置培养箱培养一段时间；(6)将培养后的细胞混悬液收集于流式检测管中，微量离心机离心，弃培养液，进行Annexin V
‑
PE/7AAD染色标记后，上流式细胞仪检测。2.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨振亚，李辉，刘赟，张雯，
申请(专利权)人：天津博纳戈恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：