一种荧光探针及其制备方法和生物应用技术

本发明专利技术公开了一种荧光探针及其制备方法和生物应用。所述荧光探针用于活细胞内质网实时成像，是一种非激发光依赖性的橙色荧光碳点。该橙色荧光碳点尺寸小，粒径分布在2.5

【技术实现步骤摘要】
一种荧光探针及其制备方法和生物应用


[0001]本专利技术属于材料合成及生物成像分析
，具体涉及一种定位内质网的荧光探针及其制备方法和生物应用。

技术介绍

[0002]内质网是真核细胞内最大的、最多变的封闭膜性细胞器，根据有无核糖体的附着，分为粗面内质网和滑面内质网，不仅是蛋白质、脂质、糖类的合成基地，而且在钙离子存储和信号传导等过程中也发挥着重要作用。当内质网内外环境改变造成内质网功能障碍时，会诱发内质网应激反应。研究表明，这种应激反应可能会显著扰乱细胞与其环境之间的相互作用，并导致人类疾病的产生及加重，因此，内质网最近被认为是癌症等疾病诊断与治疗的重要靶点，对其精细结构变化的实时影像分析对内质网应激相关疾病的诊断及治疗具有重要意义。
[0003]目前，碳点荧光探针成像由于其生物相容性高，抗光漂白能力强，可以实时监测细胞内反应已成为一个热门的研究课题，并已应用于细胞显影、化学传感、光动力治疗、磁共振成像等许多领域。尽管已经报道了各种用于观察内质网形态及检测其成分的各种荧光探针，但现已开发的内质网荧光探针的抗光漂白性和生物相容性仍需提高。因此，开发用于活细胞内质网实时成像的荧光探针是非常重要的。

技术实现思路

[0004]为了解决现有荧光探针抗光漂白性差，生物相容性低的技术问题，本专利技术提供一种用于活细胞内质网实时成像的荧光探针、所述荧光探针的制备方法、所述荧光探针在生物学中的应用。
[0005]本专利技术采用以下技术方案实现：一种非激发光依赖的橙色荧光碳点荧光探针，所述橙色荧光碳点的粒径分布在2.5
‑
5.5nm，平均粒径4.0nm。所述橙色荧光碳点中C、N、O的质量含量分别为80％
‑
81％、5％
‑
6％、14％
‑
15％。
[0006]本专利技术的荧光探针油水分配系数(LogP值)在1.2
‑
1.3之间，亲脂性较好，且具有内质网靶向特异性，抗光漂白性能较强，对细胞基本没有毒性。荧光探针的橙色荧光碳点(Phe
‑
CDs) 具有抗光漂白性能好，生物相容性高的特点。因此本专利技术的荧光探针特别适应用于活细胞内质网实时成像，在活细胞中观察内质网在有丝分裂过程中的形态变化。
[0007]作为上述方案的进一步改进，所述橙色荧光碳点以邻苯二胺和苯丙氨酸为原料，在聚
‑ꢀ
四氟乙烯不锈钢反应釜中经水热法反应获得。
[0008]本专利技术还提供上述荧光探针在活细胞内质网实时成像中的应用，尤其是在活细胞中观察内质网在有丝分裂过程中的形态变化的应用。
[0009]本专利技术还提供一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0010](1)将邻苯二胺与苯丙氨酸固体一起加入超纯水中，超声溶解后转移至聚
‑
四氟乙烯内衬的反应釜中，在所述反应釜中进行高温高压反应，将附着在所述反应釜的内壁上和
浮于所述反应釜内溶液上层的棕黑色固体取出；
[0011](2)将步骤(1)得到的棕黑色固体用甲醇溶解后，先用柱层析纯化，蒸发浓缩得棕色溶液后，用薄层层析纯化取橙红色部分；将橙红色部分刮下用甲醇超声、溶解，多次过滤洗涤，去除中性二氧化硅，将剩余溶液旋转蒸发浓缩后，烘干，得到棕红色固体粉末，即所述荧光探针。
[0012]邻苯二胺是已知的较好的缩合、聚合、碳化成碳点的材料，而苯丙氨酸是作为组成人体必备蛋白质的氨基酸。用苯丙氨酸修饰邻苯二胺碳化的碳点，增加其生物相容性。
[0013]作为上述方案的进一步改进，步骤(1)中，反应温度为180℃，反应时间为8h。
[0014]作为上述方案的进一步改进，步骤(1)中，邻苯二胺、苯丙氨酸固体、超纯水的比例为： 0.15g:0.30g:60mL。
[0015]作为上述方案的进一步改进，步骤(1)中，所述反应釜为聚
‑
四氟乙烯不锈钢反应釜。
[0016]作为上述方案的进一步改进，步骤(2)中，柱层析纯化过程中洗出液为二氯甲烷与乙酸乙酯混合液(V
二氯甲烷
：V
乙酸乙酯
＝5:1)，薄层层析纯化过程中层析液为二氯甲烷和乙酸乙酯混合液(V
二氯甲烷
：V
乙酸乙酯
＝3:1)。
[0017]作为上述方案的进一步改进，步骤(2)中，用烘箱70℃烘干。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0019]1.本专利技术的橙色碳点，合成方法简单，原料廉价，易于重复；
[0020]2.本专利技术的橙色碳点实现对正常细胞与癌细胞内质网实时成像；
[0021]3.本专利技术的荧光探针具有高特异性，定位于细胞内质网，抗光漂白能力强，生物相容性高。
附图说明
[0022]图1是本专利技术的荧光探针的橙色荧光碳点的合成简要示意图。
[0023]图2是实施例中橙色荧光碳点的FT
‑
IR结果示意图。
[0024]图3是实施例中橙色荧光碳点的UV
‑
可见光谱和激发发射光谱示意图。
[0025]图4是实施例中橙色荧光碳点在不同激发光激发下的荧光发射光谱示意图。
[0026]图5是实施例中橙色荧光碳点的不同紫外照射时间下的荧光强度变化示意图。
[0027]图6是实施例中橙色荧光碳点的TEM图像示意图。
[0028]图7是实施例中橙色荧光碳点的尺寸分布结果示意图。
[0029]图8是实施例中橙色荧光碳点的XPs谱图分析示意图。
[0030]图9是实施例中橙色荧光碳点的LogP图分析示意图。
[0031]图10是实施例中橙色荧光碳点对细胞内含有的各种分析底物的选择性分析示意图。
[0032]图11是实施例中橙色荧光碳点与不同浓度的脂质体(从上到下0
‑
1000μg/mL)混合后的荧光光谱示意图。
[0033]图12是实施例中橙色荧光碳点细胞毒性分析示意图。
[0034]图13是实施例中橙色荧光碳点进细胞实时成像示意图。
[0035]图14是实施例中橙色荧光碳点在多种细胞中的共定位成像分析示意图。
[0036]图15是实施例中橙色荧光碳点对活细胞内质网超分辨荧光成像示意图。
[0037]图16是实施例中橙色荧光碳点的有丝分裂期内质网形态的分析示意图。
具体实施方式
[0038]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步地详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0039]实施例1
[0040]本专利技术的荧光探针是一种用于活细胞内质网实时成像的荧光探针，包括非激发光依赖性的橙色荧光碳点。所述橙色荧光碳点的粒径分布在2.0
‑
6.0nm，所述橙色荧光碳点中C、N、 O的质量含量分别为80％
‑
81％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光探针，其特征在于，包括非激发光依赖性的橙色荧光碳点，所述橙色荧光碳点的粒径分布在2.5
‑
5.5nm，平均粒径4.0nm；所述橙色荧光碳点中C、N、O的质量含量分别为80％
‑
81％、5％
‑
6％、14％
‑
15％。2.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述橙色荧光碳点以邻苯二胺和苯丙氨酸为原料，在聚
‑
四氟乙烯不锈钢反应釜中经水热法反应获得。3.一种如权利要求1或2所述的荧光探针在活细胞内质网实时成像中的应用。4.一种如权利要求1或2所述的荧光探针在活细胞中观察内质网在有丝分裂过程中的形态变化的应用。5.一种荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将邻苯二胺与苯丙氨酸固体一起加入超纯水中，超声溶解后转移至聚
‑
四氟乙烯内衬的反应釜中，在所述反应釜中进行高温高压反应，将附着在所述反应釜的内壁上和浮于所述反应釜内溶液上层的棕黑色固体取出；(2)将步骤(1)得到的棕黑色固体用甲醇溶解后，先用柱层析纯化，蒸发浓缩得...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佳佳，韩光梅，张瑞龙，刘正杰，张忠平，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：