简便RNA建库方法技术

本发明专利技术提供一种简便RNA建库方法，其特征在于：其步骤包括：(1)提取样本中RNA，加入逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针并片段化；(2)RNA逆转录，获得DNA/RNA杂交双链；(3)接头连接：使用T4 DNA连接酶突变体K159L在DNA/RNA杂交链cDNA 3

【技术实现步骤摘要】
简便RNA建库方法


[0001]本专利技术专利涉及一种简便RNA建库方法，属于生物


技术介绍

[0002]RNA二代测序技术(RNA Next
‑
generation sequencing,RNA
‑
seq)是一种高通量大规模的RNA并行测序技术，可以同时对几十万乃至几百万个RNA分子进行序列测定，用于未知病原的鉴定、生物遗传进化分析、基因表达差异分析和RNA合成及加工分析等。因此，RNA
‑
seq广泛用于科学研究和疾病诊断等领域，并取得了许多突破性的结果。
[0003]RNA NGS文库构建是指通过逆转录和接头连接等过程将RNA转化为二代测序仪可识别的双链DNA的过程，是RNA
‑
seq的关键步骤。传统的RNA建库方法操作繁琐，需要通过RNA片段化、逆转录、二链合成、磁珠回收、末端修复、接头连接、磁珠回收、文库扩增和磁珠回收等9个步骤才能完成RNA文库的构建，整个流程操作繁琐，RNA损失严重、耗时长(需要5个小时)，非常不适合自动化建库和低丰度RNA建库。此外，由于RNA中包含90％左右的核糖体RNA(rRNA)，因此在RNA建库前需要进行rRNA的去除。常规的RNaseH切割法和杂交捕获法去除rRNA需要近2个小时，大大地增加了RNA建库的难度和耗时。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种简便RNA建库方法，极大地简化了RNA建库过程中rRNA去除的流程。
[0005]一种简便RNA建库方法，其特征在于：其步骤包括：
[0006](1)提取样本中RNA，加入逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针并片段化，其中的rRNA逆转录阻碍探针可以参考202110257924.X记载的内容，在该步骤中，片段化的过程与逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针退火的过程是同步进行的，更节约程序；
[0007](2)RNA逆转录，获得DNA/RNA杂交双链；
[0008](3)接头连接：使用T4 DNA连接酶突变体K159L在DNA/RNA杂交链cDNA 3
’
端连上带有腺苷酰化修饰的平末端双链DNA接头；
[0009](4)文库扩增及回收。
[0010]优选的，步骤(3)中平末端双链DNA接头是由AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT和CTCTTCCGATCT两条序列退火形成的双链DNA接头，GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT长链的5
’
端预腺苷化，3
’
端进行NH2C6修饰或者ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭；CTCTTCCGATCT短链的3
’
进行ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭。
[0011]优选的，双链DNA接头中长链与短链按照1：2
‑
1：100的摩尔浓度比例混合后进行退火。
[0012]优选的，双链DNA接头使用浓度为0.01
‑
1uM。
[0013]优选的，步骤(3)的连接反应使用的反应缓冲液中包含10
‑
200mM三羟甲基氨基甲烷、3
‑
30mM氯化镁、3
‑
30mM二硫苏糖醇和3
‑
30％聚乙二醇8000。
[0014]优选的，步骤(1)中逆转录引物序列为GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCN6
‑
20，其中N6
‑
20为6
‑
20个碱基的随机引物。
[0015]优选的，逆转录引物的使用浓度为10
‑
500uM。
[0016]优选的，步骤(1)中片段化的程序为95℃7min，75℃1min，55℃1min，保存于25℃。
[0017]优选的，步骤(2)中逆转录体系包括逆转录酶，所述逆转录酶为AMV、M
‑
MLV、TGIRT和RTX逆转录酶的一种或多种。
[0018]优选的，所述逆转录酶的使用浓度为5
‑
1000uM。
[0019]优选的，逆转录反应体系还包含10
‑
100mM三羟甲基氨基甲烷、50
‑
150mM氯化钾、1
‑
5mM氯化镁、2
‑
10mM二硫苏糖醇和0.2
‑
5U的RNA酶抑制剂；逆转录反应的程序为25℃10min，42℃15min，70℃5min。
[0020]本专利技术的简便RNA建库方法，利用DNA连接酶突变体K159L可以高效连接DNA/RNA杂交链的原理，只需要RNA片段化、逆转录、接头连接、文库扩增和磁珠回收5步，极大地简化了RNA建库的流程和耗时。结合使用rRNA逆转录阻碍探针快速去除rRNA的技术，可以在一管内完成rRNA去除和RNA建库。整个建库过程仅需2h，操作简单、RNA损失小、成本低，非常适用于RNA自动化建库和低丰度RNA建库。
附图说明
[0021]图1随机引物长度对逆转录效率的影响。
[0022]图2简便RNA建库原理和流程示意图。
[0023]图3简便RNA建库文库电泳结果。
[0024]图4用于简便RNA建库的逆转录酶筛选。
[0025]图5用于简便RNA建库的DNA聚合酶筛选。
[0026]图6简便RNA建库和传统RNA建库流程对比。
[0027]图7简便RNA建库和传统RNA建库文库产量对比。
具体实施方式
[0028]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做进一步说明。
[0029]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。本实施例所使用的探针和引物序列及修饰如表1所示，N为随机碱基，即A、T、C、G中任意一种碱基。
[0030]表1探针及引物序列
[0031][0032]实施例1：随机引物长度对逆转录效率的影响
[0033]在本实施例中，我们验证了6
‑
20nt随机引物长度(表1序号1
‑
8)对逆转录效率的影响。具体实施方式如下：
[0034]表2
[0035][0036]94℃2min，94℃
‑
25℃0.1℃/s，4℃保存。
[0037]表3
[0038]组分用量上述反应体系16μL
0.1M DTT2μLSuperScript
TM III RT(200U/μL，ThermoFisher)1μLSUPERase
·
In
TM RNase抑制剂(20U/μL)1μLTotal20μL
[0039]25℃10min，42℃15min，85℃5min，4℃保存。对Actin和28S 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种简便RNA建库方法，其特征在于：其步骤包括：(1)提取样本中RNA，加入逆转录引物和rRNA逆转录阻碍探针并片段化；(2)RNA逆转录，获得DNA/RNA杂交双链；(3)接头连接：使用T4 DNA连接酶突变体K159L在DNA/RNA杂交链cDNA 3
’
端连上带有腺苷酰化修饰的平末端双链DNA接头；(4)文库扩增及回收。2.根据权利要求1所述的简便RNA建库方法，其特征在于：步骤(3)中平末端双链DNA接头是由AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT和CTCTTCCGATCT两条序列退火形成的双链DNA接头，GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT长链的5
’
端预腺苷化，3
’
端进行NH2C6修饰或者ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭；CTCTTCCGATCT短链的3
’
进行ddT双脱氧核苷酸修饰进行封闭。3.根据权利要求2所述的简便RNA建库方法，其特征在于：双链DNA接头中长链与短链按照1：2
‑
1：100的摩尔浓度比例混合后进行退火。4.根据权利要求2所述的简便RNA建库方法，其特征在于：双链DNA接头使用浓度为0.01
‑
1uM。5.根据权利要求2所述的简便RNA建库方法，其特征在于：步骤(3)的连接反应使用的反应缓冲液中包含10
‑
200mM三羟甲基氨基甲烷、3
‑
30mM氯化镁、3
...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，王嫚，侯策，刘倩，孙睿，江翱，陈晶晶，曹振，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：