检测HPV16的试剂、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于基因检测技术领域，公开了检测HPV16的试剂、试剂盒及应用。该检测HPV16的试剂，可以实现同管一步法稳定、高灵敏地检测HPV16，可检测到个位数的基因拷贝数：无需对RT

【技术实现步骤摘要】
检测HPV16的试剂、试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及检测HPV16的试剂、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，由单一亚型高危型人类乳头瘤病毒(Human Papilloma virus，简称HPV)持续感染引起的。HPV属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒属，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤劲膜的鳞状上皮增殖。HPV包括六个早期调控基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和两个晚期基因(L1、L2)。早期基因参与病毒DNA的复制、转录、翻译和细胞转化等功能，而晚期基因的功能是编码病毒的衣壳蛋白。其中E6、E7两个早期基因分别抑制了肿瘤的抑癌基因P53和Rb而与宫颈癌的发生、发展存在直接关系。HPV按照危险程度可以分为低危型和高危型，高危型易造成宫颈癌。研究表明，99.7％的宫颈癌与高危型HPV感染有关，其中80％的高危型HPV感染为无致癌风险的一过性感染，两年内将自行消退；20％高危型HPV感染为有潜在致癌风险的持续性/整合感染，但只有伴随持续性E6、E7 mRNA转录，产生E6、E7癌蛋白，才会最终致癌。E6、E7 mRNA是目前宫颈癌最佳的风险评估指标。在感染的潜伏期或宫颈癌前病变阶段检测出高危型HPV并采取适当的治疗措施，可以有效地阻断宫颈癌的发生。因此，检测高危型HPV的E6、E7基因的核酸(包括DNA或mRNA)，特别是mRNA的检测，对于宫颈癌的早期防治，具有重要的临床意义。已知的HPV亚型16型和18型两种病毒造成75％以上的宫颈癌病例。
[0003]HPV的持续感染是宫颈癌发生的必要条件，通过在宫颈脱落细胞中检测HPV核酸已经成为筛查宫颈癌及癌前病变的重要手段。目前HPV DNA检测技术按照技术原理主要分为杂交法，实时定量PCR法，第二代杂交捕获法，焦磷酸测序法及飞行质谱技术，并且HPV DNA分型检测技术也越发受到关注。以杂交法为基础建立的检测HPV DNA的方法主要有：原位杂交，荧光原位杂交，Southern Blot，微阵列技术，导流杂交基因芯片，荧光探针标记的侧向层析技术和反向点杂交等。以上方法可在一定程度上检测到HPV感染并可应用于分型检测，但是也存在灵敏度较低，步骤多，操作繁琐，费时耗力，需要特殊的仪器设备，检测成本昂贵，通量低，不适合大通量临床样品的筛查等缺点。并且杂交法需要与多重聚合酶链反应相结合，检测分析至少需要两步以上反应所得产物，无疑增加了操作，污染和检测时间。实时定量PCR作为高灵敏度，高准确性和定量的核酸检测技术，在HPV DNA分型定量检测中得到广泛应用，具有操作简单，快速，灵敏度高和可定量等优点，商品化的试剂盒也已经广泛应用于临床检测。然而该方法通量低，成本较高，需要依赖精细温控变化的仪器与专业操作人员等。第二代杂交捕获技术检测是一种将HPV DNA与溶液中标记的RNA探针杂交并利用非同位素信号放大系统进行检测的方法，其扩增的是检测信号，而不是靶片段DNA的量，因此不需要与多重聚合酶链反应结合。但是该方法不能对HPV进行分型，灵敏度与准确度不如结合PCR的方法，并且步骤较多，操作繁琐，耗时长。焦磷酸测序是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标DNA片段，可用于HPV分型，定量性能好，准确性高，但是该技术需要与巢式PCR结合，操作步骤多，通量较低，检测成本也较高。飞行质谱技术是一种定
量检测不同荷质比的技术，具有高灵敏度，高特异性，高通量的优点，但是检测成本昂贵，依赖高尖端质谱仪器，高通量筛查也易造成资源浪费。
[0004]HPV mRNA检测是目前宫颈癌最佳的风险评估指标，2006年欧洲生殖器感染及肿瘤研究组织认为HPV E6/E7 mRNA检测可以作为HPV相关的分子标记物之一进行研究。而随着分子生物学与生物信息学的快速发展和有机结合,基于核酸扩增的技术也得到了快速的发展。如RT
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PCR技术、核酸杂交技术、双链RNA(dsRNA)电泳技术、环介导等温扩增技术等在病毒检测中的应用日趋广泛。目前商业化的HPV E6/E7 mRNA检测方法主要有美国Hologic公司的Aptima HPV检测技术、美国Diacarta公司的QuantiVirus HPV检测技术、法国BioMerieux公司的NucliSENS Easy HPV检测技术以及挪威PreTectAS公司的Pre
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Tect HPV
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Proofer HPV检测技术。这些技术涉及基于转录介导等温扩增技术(TMA)原理、基于分支链DNA信号放大技术(bDNA)原理以及基于实时多重核酸序列依赖性扩增技术(Real
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Time NASBA)原理。我国HPV mRNA检测方法比较繁多，常用RT
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PCR和杂交捕获法。以上所提方法均可有效检测临床样本中存在的高危型HPV E6/E7 mRNA，但专业性强，依赖专业仪器，操作步骤繁琐且成本较高，不利于高危型HPV筛查工作的大范围开展。临床急需一种检测速度快且灵敏度高的检测技术，更有利于患者的及时诊治。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一方面的目的，在于提供一种检测HPV16的试剂。
[0006]本专利技术的第二方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的试剂的应用。
[0007]本专利技术的第三方面的目的，在于提供一种包含本专利技术第一方面的检测HPV16的试剂的试剂盒。
[0008]本专利技术的第四方面的目的，在于提供本专利技术第三方面的试剂盒的应用。
[0009]本专利技术的第五方面的目的，在于提供一种非诊断目的的HPV或HPV16检测方法。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0011]本专利技术的第一个方面，提供一种检测HPV16的试剂，包含：检测HPV16
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E6的试剂和/或检测HPV16
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E7的试剂；
[0012]所述检测HPV16
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E6的试剂为(1)或(2)；
[0013](1)所述检测HPV16
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E6的试剂包含扩增HPV16
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E6的引物对和检测HPV16
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E6的CrRNA；
[0014]所述扩增HPV16
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E6的引物对用于扩增HPV16
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E6基因特定片段；
[0015]所述HPV16
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E6基因特定片段的序列如HPV16基因的第7152～7269位核苷酸序列所示；
[0016]所述扩增HPV16
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E6的引物对包括扩增HPV16
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E6的正向引物和扩增HPV16
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E6的反向引物；
[0017]所述扩增HPV16
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E6的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV16
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E6的反向引物1；
[0018]所述检测HPV16本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种试剂，包含：检测HPV16
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E6的试剂和/或检测HPV16
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E7的试剂；所述检测HPV16
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E6的试剂为(1)或(2)；(1)所述检测HPV16
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E6的试剂包含扩增HPV16
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E6的引物对和检测HPV16
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E6的CrRNA；所述扩增HPV16
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E6的引物对用于扩增HPV16
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E6基因特定片段；所述HPV16
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E6基因特定片段的序列如HPV16基因的第7152～7269位核苷酸序列所示；所述扩增HPV16
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E6的引物对包括扩增HPV16
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E6的正向引物和扩增HPV16
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E6的反向引物；所述扩增HPV16
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E6的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV16
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E6的反向引物1；所述检测HPV16
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E6的CrRNA包含HPV16
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E6
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CrRNA的锚定序列和HPV16
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E6
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CrRNA的向导序列，所述HPV16
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E6
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CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV16
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E6
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CrRNA的向导序列与所述HPV16基因的负链的第7185～7212位核苷酸序列特异性识别；(2)所述检测HPV16
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E6的试剂包含扩增HPV16
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E6的引物对和检测HPV16
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E6的CrRNA；所述扩增HPV16
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E6的引物对用于扩增HPV16
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E6基因特定片段；所述HPV16
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E6基因特定片段的序列如HPV16基因的第7404～7540位核苷酸序列所示；所述扩增HPV16
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E6的引物对包括扩增HPV16
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E6的正向引物和扩增HPV16
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E6的反向引物；所述扩增HPV16
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E6的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV16
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E6的反向引物2；所述检测HPV16
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E6的CrRNA包含HPV16
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E6
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CrRNA的锚定序列和HPV16
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E6
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CrRNA的向导序列，所述HPV16
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E6
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CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV16
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E6
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CrRNA的向导序列与所述HPV16基因的负链的第7442～7469位核苷酸序列特异性识别；所述检测HPV16
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E7的试剂为(3)或(4)；(3)所述检测HPV16
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E7的试剂包含扩增HPV16
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E7的引物对和检测HPV16
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E7的CrRNA；所述扩增HPV16
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E7的引物对用于扩增HPV16
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E7基因特定片段；所述HPV16
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E7基因特定片段的序列如HPV16基因的第7695～7839位核苷酸序列所示；所述扩增HPV16
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E7的引物对包括扩增HPV16
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E7的正向引物和扩增HPV16
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E7的反向引物；所述扩增HPV16
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E7的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV16
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E7的反向引物1；所述检测HPV16
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E7的CrRNA包含HPV16
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E7
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CrRNA的锚定序列和HPV16
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E7
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CrRNA的向导序列，所述HPV16
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E7
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CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV16
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E7
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CrRNA的向导序列与所述HPV16基因的负链的第7733～7760位核苷酸序列特异性识别；(4)所述检测HPV16
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E7的试剂包含扩增HPV16
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E7的引物对和检测HPV16
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E7的CrRNA；所述扩增HPV16
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E7的引物对用于扩增HPV16
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E7基因特定片段；所述HPV16
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E7基因特定片段的序列如HPV16基因的第7685～7837位核苷酸序列所示；所述扩增HPV16
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E7的引物对包括扩增HPV16
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E7的正向引物和扩增HPV16
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E7的反向引物；所述扩增HPV16
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E7的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV16
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E7的反向引物2；
所述检测HPV16
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E7的CrRNA包含HPV16
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E7
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CrRNA的锚定序列和HPV16
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E7
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CrRNA的向导序列，所述HPV16
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E7
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CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV16
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E7
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CrRNA的向导序列与所述HPV16基因的负链的第7733～7760位核苷酸序列特异性识别。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述T7 RNA聚合酶识别区的序列为GAAATTAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.24)；优选地，所述Cas蛋白为Cas13a；优选地，所述HPV16
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E6
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CrRNA和HPV16
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E7
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CrRNA的锚定序列为GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC(SEQ ID NO.25)；优选地，所述扩增HPV16
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E6的反向引物1的序列如SEQ ID NO.26所示；优选地，所述扩增HPV16
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E6的反向引物2的序列如SEQ ID NO.27所示；优选地，所述扩增HP...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宋彬，丘力功，郝宇，陆启蓝，
申请(专利权)人：广州白云山拜迪生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：