一种基于甲基转移酶核酸适配体生物纳米探针检测DNA甲基化的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于甲基转移酶核酸适配体生物纳米探针检测DNA甲基化的方法,包括以下步骤：步骤一：利用SELEX技术筛选甲基转移酶适配体；步骤二：用原子力显微镜和荧光显微镜分析筛选的适配体与甲基转移酶的作用；步骤三：设计与适配体互补的探针；步骤四：通过一步溶剂热法合成Au@Fe3O4NPs

【技术实现步骤摘要】
一种基于甲基转移酶核酸适配体生物纳米探针检测DNA甲基化的方法


[0001]本专利技术属于
，尤其是涉及一种基于甲基转移酶核酸适配体生物纳米探针检测DNA甲基化的方法。

技术介绍

[0002]DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase， DNMT)的催化下，以s
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腺苷甲硫氨酸(S
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Adenosyl methionine,SAM) 为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化与生长发育，衰老，基因表达调控，特别是和包括卵巢癌在内的多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来，DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰形式与肿瘤发生发展的关系已成为肿瘤研究领域的热点之一。
[0003]人类的CpG以两种形式存在，一种是分散于DNA中，另一种是位于人体70～90％基因的转录调控区附近(启动子或第一外显子中)的一段CG二核苷酸高度密集的区域，即CpG岛(CpG island)。在哺乳动物正常组织里，散在的CpG通常是甲基化的，而CpG岛大部分处于非甲基化状态。肿瘤组织的DNA甲基化改变表现为总体的甲基化水平降低与启动子区CpG岛的甲基化水平升高。甲基化干扰基因表达的机制可能有两种：(1)CpG甲基化本身使得转录因子不能有效结合到启动子上；(2)甲基化的CpG二核苷酸序列可被甲基结合蛋白家族(Methyl
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CpG
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Binding Domain，MBD)包含有MeCP2、 MeCPl/MBDl、MBD2、MBD4等所识别，而后者可通过吸引补充组蛋白去乙酰化酶和组蛋白甲基化转移酶等组蛋白修饰蛋白质来改变染色质的活性，从而阻断转录因子与基因调控序列的结合，由此导致基因转录沉默。抑癌基因与修复基因的甲基化导致抑癌基因沉默与修复基因失活，造成肿瘤抑制丧失与基因损伤增加，而总体的低甲基化使反转录转座子、癌基因活化，导致肿瘤最终发生。但由于肿瘤的发生发展和转移是一个多基因共同参与的过程，且肿瘤组织存在不均一性，因此单个基因的检测对肿瘤的诊断和预后不够准确，能从基因组水平找到甲基化谱标志物对临床实际应用具有重要意义。
[0004]在哺乳动物，DNA甲基化的重要产物之一5
’
甲基胞嘧啶是真核细胞DNA中唯一天然存在的修饰碱基，其甲基化位点90％存在于CpG序列中，而5
’
甲基胞嘧啶的水平可以反映较大的甲基化水平差异。高等真核生物的DNA甲基化主要是通过DNMT家族催化来实现的。目前已报道的DNMT家族成员有：DNMTl(维持甲基化)， DNMT2，DNMT3A，DNMT3B(重头甲基化)和DNMT3L(增强前二者的作用)。有研究报道，异常的DNMT的活性升高导致抑癌基因CpG 岛的高甲基化改变有望成为独立于肿瘤发展过程的早期监测指标。5
’
甲基胞嘧啶和异常的DNA甲基转移酶DNMT1的活性升高导致的抑癌基因沉默有关，检测5
’
甲基胞嘧啶和DNA甲基转移酶有望成为早期发现肿瘤和风险预测极具潜力的手段。基因组CpG岛的整体甲基化水平改变独立于肿瘤发展过程的多项临床指标，可能发生于肿瘤形成的早期，参与肿瘤的发生，有望成为传统诊断方法之外的独立指标。目前常用的检测整体甲基化水平的方法Global DNA methylation assay主要有：甲基化特异性的质谱法(MassSpectrometry,MS)，酶联免疫吸
附法(Enzyme
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linked immunosorbentassay,ELISA)和光度甲基化分析法(Luminometric methylationassay,LUMA)等。目前众多的整体甲基化水平检测方法因操作繁琐，设备价格昂贵都各自具有一定的局限性，尚未大规模普及应用于临床。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了克服现有技术的不足，提供一种基于甲基转移酶核酸适配体生物纳米探针检测DNA甲基化的方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于甲基转移酶核酸适配体生物纳米探针检测DNA甲基化的方法,包括以下步骤：
[0007]步骤一：利用SELEX技术筛选甲基转移酶适配体；
[0008]步骤二：用原子力显微镜和荧光显微镜分析筛选的适配体与甲基转移酶的作用；
[0009]步骤三：设计与适配体互补的探针；
[0010]步骤四：通过一步溶剂热法合成Au@Fe3O4NPs
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rGO纳米复合粒子；
[0011]步骤五：用透射电镜、扫描电镜和UV
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VIS对Au@Fe3O4NPs
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rGO 纳米复合粒子进行表征；
[0012]步骤六：通过Au@Fe3O4NPs
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rGO纳米复合粒子固定探针和蔗糖酶，制备金标蔗糖酶
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探针。
[0013]步骤七：构建生物传感界面；
[0014]步骤八：通过血糖仪检测甲基转移酶，将样品放置在放置板上，并通过固定机构将样品固定在放置板上，然后通过驱动机构将拉动放置板，将样品移动到测定模块正下方，启动血糖仪进行检测；以纳米粒子为载体可以将蔗糖分子高比例的负载于纳米粒子表面，然后和再与金标蔗糖酶
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检测探针结合。通过Au
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S将巯基化的适配体自组装到自主合成的Au@Fe3O4NPs
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rGO纳米复合磁珠上，借助免疫磁珠的超顺磁性、大比表面积和核酸适体的高亲和力、高特异性，从复杂的生物样品中分离富集特定的靶DNA片段。两条链互补结合后形成的双链富含5
′…
CCGG
…3′
重复序列，而5
′…
CCGG
…3′
为特定甲基转移酶和限制性内切酶的识别位点，甲基转移酶特异地作用于5
′…ꢀ
CCGG
…3′
位点使其甲基化，而限制性内切酶用于切割未甲基化的胞嘧啶。通过甲基转移酶核酸适配体对甲基转移酶特异的空间变构作用，带有蔗糖酶分子的互补链游离出来，加入底物蔗糖通过蔗糖酶的水解作用下生成一分子果糖和一分子葡萄糖，从而被快速血糖仪识别并检测。
[0015]构建具有特异性识别能力和强大信号放大能力的纳米探针，利用核酸适体的靶向特异性产生的信号扩增效应实现靶甲基转移酶的活性检测，从而实现间接的DNA甲基化的间接超灵敏检测。
[0016]优选的，所述固定机构包括、设于所述放置板上的多个吸盘、气囊及连接所述气囊与吸盘的连接管，所述放置板设有通气腔和通气孔；按压气囊可将通气腔内的空气从通气孔处排出，然后将样品放置在吸盘上，松开气囊，将在吸盘处形成负压，将样品固定在吸盘上。
[0017]优选的，所述驱动机构包括限位板、转轴、设于所述转轴上的绕线轮、限位套筒、设于所述限位套筒上的滚柱、连接线及定位组件，所述连接线一端固定在绕线轮上，另一端固定在放置板上；转动转轴，带动绕线轮转动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于甲基转移酶核酸适配体生物纳米探针检测DNA甲基化的方法,其特征在于，包括以下步骤：步骤一：利用SELEX技术筛选甲基转移酶适配体；步骤二：用原子力显微镜和荧光显微镜分析筛选的适配体与甲基转移酶的作用；步骤三：设计与适配体互补的探针；步骤四：通过一步溶剂热法合成Au@Fe3O4NPs
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rGO纳米复合粒子；步骤五：用透射电镜、扫描电镜和UV
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VIS对Au@Fe3O4NPs
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rGO纳米复合粒子进行表征；步骤六：通过Au@Fe3O4NPs
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rGO纳米复合粒子固定探针和蔗糖酶，制备金标蔗糖酶
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探针。步骤七：构建生物传感界面；步骤八：通过血糖仪检测甲基转移酶，将样品放置在放置板上，并通过固定机构将样品固定在放置板上，然后通过驱动机构将拉动放置板，将样品移动到测定模块正下方，启动血糖仪进行检测。2.根据权利要求1所述的一种基于甲基转...

【专利技术属性】
技术研发人员：逯岭松，刘蓓，马宵，周建平，
申请(专利权)人：杭州市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：