一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因PeARF18及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因PeARF18及其应用。本发明专利技术第一方面提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因PeARF18，具有以下核苷酸序列中的一种：1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。本发明专利技术通过基因工程的手段有效调控了蝴蝶兰花器官的发育，使三唇瓣蝴蝶兰的假唇瓣变成真唇瓣，从而利于昆虫对植物的传粉，同时也为蝴蝶兰的花型育种提供了重要的基础。供了重要的基础。供了重要的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因PeARF18及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因PeARF18及其应用。

技术介绍

[0002]随着人们生活水平的提高，花卉植物越来越受到人们的喜爱，人们对于不同形状的花卉有了更高的要求。为了提供更具有观赏价值和收藏价值的奇特花卉和名贵花卉，人们越来越注重研究花卉的发育机制。目前兰科植物有超过20000多种，是植物界包含种类最多的科之一。兰花花型包括外轮的三片花萼，内轮的两片花瓣以及由花瓣特化成各种形式的唇瓣，此外兰花具有雄蕊和雌蕊融合而成的合蕊柱，这种高度分化的花结构为研究兰花器官提供了良好的条件，研究观赏花卉发育机制对兰花发育模型的挖掘具有广泛的应用前景。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因PeARF18，用于提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因，使其具有独特的观赏和应用价值。
[0004]本专利技术第一方面提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因PeARF18，所述基因具有以下核苷酸序列中的一种：
[0005]1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
[0006]2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；
[0007]3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。
[0008]本专利技术第二方面提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的蛋白，所述蛋白由本专利技术第一方面提供的基因编码得到。
[0009]本专利技术第三方面提供一种重组载体，所述重组载体包含本专利技术第一方面提供的核苷酸序列。
[0010]进一步地，所述重组载体为CymMV病毒。
[0011]本专利技术第四方面提供一种重组转化体，所述重组转化体包含本专利技术第三方面提供的重组载体。
[0012]进一步地，所述重组转化体为农杆菌。
[0013]本专利技术第五方面提供本专利技术第一方面提供的基因在调控蝴蝶兰花器官发育中的应用。
[0014]本专利技术第六方面提供一种调控蝴蝶兰花器官发育的方法，对所述蝴蝶兰沉默如本专利技术第一方面提供的核苷酸序列。
[0015]进一步地，将所述核苷酸序列连接到CymMV病毒质粒上面得到重组载体，然后将所述重组载体转入农杆菌，得到重组转化体，使用所述重组转化体侵染蝴蝶兰。
[0016]进一步地，将所述重组转化体在含有100μM的乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养；
[0017]培养结束后在含有100μM乙酰丁香酮和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中继代培养，直到OD600达到0.8
‑
1.0；离心去除上清液，使细胞沉淀重悬得到转化液，将所述转化液注射到无病毒的蝴蝶兰叶片与花序中。
[0018]本专利技术通过基因工程的手段有效调控了蝴蝶兰花器官的发育，使三唇瓣蝴蝶兰的假唇瓣变成真唇瓣，从而利于昆虫对植物的传粉，同时也为蝴蝶兰的花型育种提供了重要的基础。
附图说明
[0019]图1为现有技术提供的野生型三唇瓣小兰屿蝴蝶兰的表型；
[0020]图2为本专利技术实施例提供的PeARF18的保守结构域预测图；
[0021]图3为本专利技术实施例提供的PeARF18系统进化发育分析图；
[0022]图4为本专利技术实施例提供的PeARF18转录自激活功能的验证；
[0023]图5为本专利技术实施例提供的PeARF18在本氏烟草中的亚细胞定位；
[0024]图6为本专利技术实施例提供的PeARF18在小兰屿花芽不同发育时期的表达量；
[0025]图7为本专利技术实施例提供的PeARF18在小兰屿蝴蝶兰不同组织中的表达量；
[0026]图8为本专利技术实施例提供的小兰屿蝴蝶兰在注射CymMV
‑
PeARF18，30天后的对照和沉默突变株系表型；
[0027]图9为本专利技术实施例提供的小兰屿蝴蝶兰在注射CymMV
‑
PeARF18，30天后的对照和沉默突变株系不同部位中PeARF18的表达量。
具体实施方式
[0028]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0029]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂、载体，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的。
[0030]实施例1PeARF18基因的克隆
[0031]提取如图1所示的野生型三唇瓣小兰屿蝴蝶兰花瓣总RNA，提取试剂盒为RNAplant(市售)，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA。根据转录组测序结果设计引物，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，采用RT
‑
PCR方法从小兰屿蝴蝶兰cDNA中扩增出一条2514bp的条带。PCR产物回收，获取核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因，命名为PeARF18；该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由837个氨基酸残基组成，分子量为82.76kDa千道尔顿。
[0032]实施例2PeARF18的生物信息学分析
[0033]1、将PeARF18编码的氨基酸序列放入NCBI数据库，检索同源蛋白。
[0034]2、运用https://www.genome.jp/tools
‑
bin/clustalw在线分析PeARF18编码蛋白与同源氨基酸序列之间的保守结构域，分析结果如图2所示，PeARF18具有典型的N末端的DNA结合结构区域(DBD)，中间区域(MR)，C末端的二聚化结构区(CTD)。
[0035]3、选取拟南芥中ARF基因家族氨基酸序列，运用MEGA5，分析PeARF18系统发育关系，分析结果如图3所示，PeARF18与拟南芥中的ARF2聚类在一起，并且亲缘关系较近。
[0036]实施例3PeARF18转录自激活功能的验证
[0037]1、将PeARF18基因的开放阅读框2514bp可操作地连接于pGBKT7酵母表达载体，形成含有该基因片段的pGBKT7
‑
PeARF18载体；
[0038]2、将步骤1中的pGBKT7
‑
PeARF18载体、阴性对照组pGBKT7空载以及阳性对照组Postive载体分别转入酵母菌感受态Y2H；
[0039]3、将步骤2中的三种酵母菌株在Trp选择缺陷型固本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控蝴蝶兰花器官发育的基因PeARF18，其特征在于，所述基因具有以下核苷酸序列中的一种：1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。2.一种调控蝴蝶兰花器官发育的蛋白，其特征在于，所述蛋白由权利要求1所述的基因编码得到。3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求1所述的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为CymMV病毒。5.一种重组转化体，其特征在于，所述重组转化体包含权利要求3或4所述的重组载体。6.根据权利要求5所述的重组转化体，其特征在于，所述重组转化体为农杆菌。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：明凤，徐庆于，李东世，何国仁，张栖语，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：