一种东星斑分子溯源选择育种方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种东星斑分子溯源选择育种方法及其应用，提供了一种东星斑分子溯源选择育种方法，结合国内东星斑等鱼类育种现状，实现对现存的连续多代样本进行低成本基因组重测序，通过分子溯源分析它们的亲缘关系，完成对连续多代鱼类亲缘关系的鉴定，综合多代间的优良性状，科学辅助鱼类新品种选育工作，为鱼类新品种培育提供了一种科学高效的育种方法；本发明专利技术的方法能够在性成熟周期长且已培育多代而未进行系统选育鱼类的育种工作中具有广阔的应用前景，能够成为鱼类良种培育的有力工具，对于东星斑、杉斑、虎斑以及老鼠斑等已培育多代而未科学地选育的鱼类等水产养殖品种的育种工作具有重要意义。育种工作具有重要意义。育种工作具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种东星斑分子溯源选择育种方法及其应用


[0001]本专利技术涉及海洋鱼类遗传育种
，特别涉及一种东星斑分子溯源选择育种方法及其应用。

技术介绍

[0002]随着技术的不断进步，水产育种也不断进行着技术的更新迭代，从传统群体育种、杂交育种、分子标记辅助育种等，到现在全基因组选择育种，育种技术日趋成熟，已育成大黄鱼、半滑舌鳎等多种海水鱼类新品种。
[0003]东星斑因体色艳丽、肉质细嫩、营养丰富、经济价值和观赏价值高等特点，市场前景广阔，已成为我国南方各省陆基工厂化养殖的主要种类。但东星斑性成熟周期长，主要由养殖企业进行逐代群体筛选培育，种质资源较为混乱，谱系不清，缺乏系统的选育工作。因此，亟需建立东星斑有效、可靠的个体间亲缘关系鉴定技术。
[0004]高通量测序和基因分型技术的出现，利用SNP标记构建基因组亲缘关系矩阵，来替代传统的系谱记录亲缘关系已经展开了大量的研究，并证实可纠正谱系亲缘记录错误，比传统谱系记录更有效，但该技术对群体表型样品量要求高，且成本高。因此，建立全基因组分子溯源技术，对实现海洋鱼类亲缘关系鉴定、评估某动物品种的育成历史和品种纯度、保护地方特色品种、预测杂种优势（即评估杂交品种对特定生产环境的适应性），进而实现杂交计划和杂交育种方案的精准设计具有重要意义。

技术实现思路

[0005]鉴以此，本专利技术为已培育多代而未进行系统选育的东星斑提供一种高效、科学、系统的育种方法，所述方法首先分别提取各代个体的DNA并建库，进行全基因组重测序分析，建立该物种单倍型库，综合分析出每个个体所选育性状的基因型，并对不同代间的不同个体进行亲缘关系的确认，再鉴定出已有的连续多代个体间的亲缘关系后测定它们的目标性状，如生长、抗病、体色或耐寒等其它重要生产性状。随后，结合多代个体已测取的性状回溯优质子代群体的亲本及祖代信息，确定优质群体各代亲本的遗传信息，进而在对已培育的连续多代群体进行科学系统的鉴定和评估的基础上，指导下一步的育种工作，快速高效地培育出健康稳定的优质新品种。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：一种东星斑分子溯源选择育种方法，包括以下步骤：S1.建立全基因重测序文库：测定已连续培育多代东星斑的各代个体生长相关性状，然后取各代个体的尾鳍或鳃丝组织，分别提取总DNA，利用实验室自主建立的低成本建库方法，利用诺唯赞DNA建库试剂盒（货号：ND617）建立全基因重测序文库，随后进行测序分析；优选的，所述生长相关性状包括体重、体长、体高、体宽。
[0007]优选的，取尾鳍或鳃丝组织时，以不影响个体活力为前提，取后，用RNase
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free的1
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PBS缓冲液漂洗，置于90%酒精存样，4℃保存备用。
[0008]优选的，提取总DNA的方法为酚氯仿提取法。
[0009]S2.建立单倍型库：对步骤S1测序分析后的reads进行整理和裁剪，将处理后的reads比对到已有东星斑参考基因组上，对reads进行质量检测，删除掉低质量reads并对其进行多态性位点检测分型，确定单核苷酸多态性位点分型信息，合并前述处理产生的文件，对所有高深度测序个体多态性位点分型信息进行过滤，去除高缺失率的基因型和样本，构建单倍型数据库，对低深度测序个体进行基因型填充；优选的，所述整理和裁剪为 (1) 测序质量质控，去除数据质量参数（quality，Q）小于30的碱基，即在SNP位点基因分型过程中，单位点分型正确率在99.9%以上；（2）去除带有部分接头的二聚体序列；（3）去除长度小于36 bp的reads。
[0010]其中，reads(读长)指的是测序仪单次测序所得到的碱基序列。
[0011]优选的，所述高深度测序的测序深度为20
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的东星斑个体基因组。
[0012]优选的，所述低深度测序的测序深度为5
×
的东星斑个体基因组。
[0013]优选的，所述高缺失率为缺失率≥10%。
[0014]S3.亲缘关系的鉴定及回溯亲本及祖代信息：合并步骤S2处理后的各代测序个体的vcf文件，过滤数据，计算不同代个体间的亲缘关系指数，建立亲缘关系矩阵，推断不同代个体之间的亲缘关系，筛选出系谱关系可以溯源出F0祖本和F1父母本个体的F2代个体；其中，vcf（variant call file，突变识别文件）文件是保存基因组上所有位置的突变信息的文件。
[0015]优选的，所述过滤数据为去除可信度低和质量低的SNP位点信息，即基因缺失率≥10%或次等位基因频率≤5%的SNP位点信息，其中SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的突变所引起的氨基酸序列多态性。
[0016]优选的，所述亲缘关系指数的计算为根据SNP位点的连锁不平衡，以基因频率、期望杂合度为基础计算个体间的亲缘关系。
[0017]S4.连续多代群体的鉴定评估及筛选：根据步骤S3溯源出F0、F1亲本个体和F2代个体的亲缘关系、基因型矩阵和表型性状进行育种值和遗传力评估；优选的，包括育种值评估系统，所述育种值评估系统具体如下：首先构建评估群体亲缘关系矩阵，剔除环境效应和部分遗传效应的偏差，然后对动物个体加性效应即育种值做无偏估计，最后分别应用于BLUP（最佳线性无偏预测），GBLUP（基因组最佳线性无偏预测）和PGBLUP（整合先验生物学信息的全基因组最佳线性无偏预测）比较验证育种值和遗传力的准确度；育种值评估系统的核心模型为：；其中，y是观察值，即动物性状表型值，b是固定效应（环境效应），u是遗传效应，e是随机残差，X和Z分别为环境效应和遗传效应的关联矩阵；育种值和遗传力的准确度评估核心模型：；其中，a为评估的准确度；r为育种值（EBV）与实际测量表型值的相关性系数，y1和yz分别为个体性状的EBV和表型值；h为遗传力平方根。
[0018]优选的，所述遗传力评估为评估所筛选出来的F2代群体生长相关性状。
[0019]S5.筛选优质亲本：将步骤S4所得到的育种值与步骤S3得出的亲缘关系以及个体的生长相关性状一一关联对应，综合分析测序后的全基因重测序文库，筛选出性状优良且遗传稳定的F2代个体作为亲本繁育F3代群体。
[0020]优选的，本专利技术还提供了所述的东星斑分子溯源选择育种方法在鱼类选育工作中的应用。
[0021]优选的，所述鱼类包括：东星斑、杉斑、虎斑和老鼠斑等其他水产养殖鱼类。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种东星斑分子溯源选择育种方法，结合国内东星斑等鱼类育种现状，实现对现存的连续多代样本进行低成本基因组重测序，通过分子溯源分析它们的亲缘关系，完成对连续多代鱼类亲缘关系的鉴定，综合多代间的优良性状，科学辅助鱼类新品种选育工作，为鱼类的新品种培育提供了一种科学高效的育种方法，可应用于东星斑、杉斑、虎斑以及老鼠斑等已培育多代而未科学地选育的鱼类等其它水产养殖品种的培育工作，在性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种东星斑分子溯源选择育种方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.建立全基因重测序文库：测定已连续培育多代东星斑的各代个体生长相关性状，然后取各代个体的尾鳍或鳃丝组织，分别提取总DNA，建立全基因重测序文库，随后进行测序分析；S2.建立单倍型库：对步骤S1测序分析后的reads进行整理和裁剪，然后比对到已有东星斑参考基因组上，对reads进行处理，再进行多态性位点检测分型，然后过滤高深度测序个体的多态性位点分型信息，构建单倍型数据库，对低深度测序个体进行基因型填充；S3.分子溯源鉴定亲缘关系：合并步骤S2处理后的各代测序个体的vcf文件，过滤数据，计算不同代个体间的亲缘关系指数，推断不同代个体之间的亲缘关系，筛选出系谱关系可以溯源出F0祖本和F1父母本个体的F2代个体；S4.连续多代群体的鉴定评估及筛选：根据步骤S3溯源出F0、F1亲本个体和F2代个体的亲缘关系、基因型矩阵和表型性状进行育种值和遗传力评估；S5.筛选优质亲本：将步骤S4所得到的育种值与步骤S3得出的亲缘关系以及个体的生长相关性状一一关联对应，综合分析测序后的全基因重测序文库，筛选出性状优良且遗传稳定的F2代个体作为亲本繁育F3代群体。2.如权利要求1所述的东星斑分子溯源选择育种方法，其特征在于，所述生长相关性状包括体重、体长、体高、体宽。3.如权利要求1所述的东星斑分子溯源选择育种方法，其特征在于，所述整理和裁剪为 (1)去除数据质量参数小于30的碱基；（2）去除带有部分接头的二聚体序列；（3）去除长度小于36 bp的reads。4.如权利要求1所述的东星斑分子溯源选择育种方法，其特征在于，所述步骤S2建立单倍型库为对步骤S1测序分析后的reads进行整理和裁剪，然后比对到已有东星斑参考基因组上，对reads进行质量检测，删除掉低质量reads并对其进行多态性位点检测分型，确定单核苷酸多态性位点分型...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡景杰，包振民，汪波，曾启繁，王扬帆，吴绍轩，韩文韬，
申请(专利权)人：中国海洋大学三亚海洋研究院，
类型：发明
国别省市：