山鸡椒的遗传转化方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种山鸡椒的遗传转化方法和应用，涉及生物技术领域。本发明专利技术提供的山鸡椒的遗传转化方法，采用抽真空处理和在侵染液中添加葡萄糖的方式处理山鸡椒无菌苗的愈伤组织，实现山鸡椒的遗传转化，该方法遗传转化效率高(4％)，突破富含次生代谢物的植物组织的易褐化问题，培育周期短，并且遗传转化体系稳定；或者在侵染液侵染转化山鸡椒无菌苗过程中进行抽真空处理，可在48

【技术实现步骤摘要】
山鸡椒的遗传转化方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种山鸡椒的遗传转化方法和应用。

技术介绍

[0002]山鸡椒(Litsea cubeba(Lour.)Pers.)，又名山苍子，为樟科(Lauraceae)木姜子属(Litsea Lam)的多年生灌木或小乔木，喜光，雌雄异株，原产自亚洲，主要分布在我国长江以南的数十个省份。山鸡椒全株均含油，传统利用部位果实的含油量可达3.0％
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11.0％。山鸡椒精油是我国香精香料行业的主要产品之一，长期以来生产量和出口量居世界第一位。其精油成分中含有丰富的萜类化合物，使其兼具抗氧化、杀虫和抗菌等生物活性，具有广阔的开发应用前景。植物分子育种为山鸡椒的定向育种和遗传改良提供了新的途径，利用转基因技术将基因引入山鸡椒细胞并稳定遗传，从而创造新种质，是山鸡椒育种的新方向。
[0003]农杆菌介导法是常见的植物遗传转化方法之一，具有操作简单、成本低且转化率高的优点。然而，由于山鸡椒及其所在的樟科树种大部分富含萜类化合物及多糖多酚物质，导致其组织容易褐化，且遗传转化困难，而且山鸡椒叶片薄，果实小，无法利用传统的无针注射器将农杆菌侵染液注入组织。因此，山鸡椒的遗传转化体系未建立，严重阻碍了山鸡椒的分子育种和新种质创制。
[0004]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一目的在于提供一种山鸡椒的遗传转化方法，以解决上述问题中的至少一种。
[0006]本专利技术的第二目的在于提供上述山鸡椒的遗传转化方法在樟科树种遗传转化中的应用。
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种山鸡椒的遗传转化方法，包括以下步骤：
[0008]a.取山鸡椒无菌苗，诱导得到愈伤组织；
[0009]b.将a步骤得到的愈伤组织置于溶液中进行第一次抽真空处理；
[0010]c.采用含有农杆菌的侵染液A侵染转化b步骤得到的愈伤组织；
[0011]d.将c步骤得到的愈伤组织进行筛选，经过生芽生根后获得山鸡椒转基因植株；
[0012]或者，e.采用含有农杆菌的侵染液B侵染转化山鸡椒无菌苗，同时进行第二次抽真空处理，培养后获得山鸡椒转基因植株；
[0013]所述侵染液A中含有葡萄糖。
[0014]作为进一步技术方案，山鸡椒无菌苗的获得方法包括：取山鸡椒茎段经浸泡、消毒后转入芽诱导培养基中培养出萌发芽，然后将萌发芽转移至继代培养基中培养，获得山鸡椒无菌苗；
[0015]优选地，将萌发芽转移至继代培养基中培养至5
‑
8cm之后还包括将芽接种至生根
培养基中培养，获得山鸡椒无菌苗；
[0016]优选地，所述消毒的方式包括在65％
‑
75％乙醇中浸泡45
‑
60s，然后在0.1％
‑
0.2％氯化汞中浸泡10
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12min；
[0017]优选地，所述芽诱导培养基中培养配方为：MS 4
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5g
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‑1+蔗糖27
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33g
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‑1+琼脂7
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‑1+IBA 0.18
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‑1，PH5.5
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[0018]更优选地，所述芽诱导培养基中培养配方为：MS 4.43g
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[0019]优选地，所述继代培养基配方为：MS 4
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[0021]优选地，所述生根培养基配方为：1/2MS 2
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[0023]作为进一步技术方案，所述诱导得到愈伤组织的步骤包括：取山鸡椒无菌苗的茎段在愈伤诱导培养基中培养，17
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21天后再转移至愈伤继代培养基中弱光培养10
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12天获得愈伤组织；
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[0025]更优选地，所述愈伤诱导培养基配方为：MS 4.43g
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‑1+蔗糖30g
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种山鸡椒的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：a.取山鸡椒无菌苗，诱导得到愈伤组织；b.将a步骤得到的愈伤组织置于溶液中进行第一次抽真空处理；c.采用含有农杆菌的侵染液A侵染转化b步骤得到的愈伤组织；d.将c步骤得到的愈伤组织进行筛选，经过生芽生根后获得山鸡椒转基因植株；或者，e.采用含有农杆菌的侵染液B侵染转化山鸡椒无菌苗，同时进行第二次抽真空处理，培养后获得山鸡椒转基因植株；所述侵染液A中含有葡萄糖。2.根据权利要求1所述的山鸡椒的遗传转化方法，其特征在于，山鸡椒无菌苗的获得方法包括：取山鸡椒茎段经浸泡、消毒后转入芽诱导培养基中培养出萌发芽，然后将萌发芽转移至继代培养基中培养，获得山鸡椒无菌苗；优选地，将萌发芽转移至继代培养基中培养至5
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8cm之后还包括将芽接种至生根培养基中培养，获得山鸡椒无菌苗；优选地，所述消毒的方式包括在65％
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75％乙醇中浸泡45
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60s，然后在0.1％
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0.2％氯化汞中浸泡10
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12min；优选地，所述芽诱导培养基中培养配方为：MS 4
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5.9；更优选地，所述芽诱导培养基中培养配方为：MS 4.43g
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‑1，PH5.7；优选地，所述继代培养基配方为：MS 4
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‑1；更优选地，继代培养基配方为：MS 4.43g
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‑1；优选地，所述生根培养基配方为：1/2MS 2
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‑1+头孢霉素140
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5.9；更优选地，生根培养基配方为：1/2MS 2.17g
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‑1+头孢霉素150mg
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‑1，PH5.7。3.根据权利要求1所述的山鸡椒的遗传转化方法，其特征在于，所述诱导得到愈伤组织的步骤包括：取山鸡椒无菌苗的茎段在愈伤诱导培养基中培养，17
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21天后再转移至愈伤继代培养基中弱光培养10
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12天获得愈伤组织；优选地，所述愈伤诱导培养基配方为：MS 4
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‑1+蔗糖27
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5.9；更优选地，所述愈伤诱导培养基配方为：MS 4.43g
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‑1+琼脂7.5g
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【专利技术属性】
技术研发人员：汪阳东，王民炎，高暝，陈益存，吴立文，赵耘霄，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：