一种磷酸化TaupT181蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用，本发明专利技术以包含tau蛋白的181位苏氨酸(T181)磷酸化的抗原序列免疫复合物和包含tau蛋白211～239位氨基酸的抗原序列免疫复合物进行动物免疫，制备出磷酸化Tau pT181蛋白的单克隆抗体和tau(211～239)蛋白多克隆抗体，所述磷酸化Tau pT181蛋白的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株Tau

【技术实现步骤摘要】
一种磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种以进行性痴呆为主要特征的神经元退行性疾病，多出现在老年时期。其特有的病理改变为神经元内病理性tau蛋白纤维导致的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)及细胞外β
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淀粉样多肽(β
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amyloid peptide，Aβ)沉积形成的神经炎性斑块，临床上表现为进行性认知功能障碍和记忆力衰退、性格和行为改变、判断力下降、社交障碍、生活自理能力丧失。目前国内外研究认为，临床认知功能下降主要与NFTs的数量密切，NFTs主要由成对螺旋纤丝(paired helical filament，PHF)构成，其主要成分是过度磷酸化的tau蛋白的各种异构体。
[0003]tau蛋白是微管相关蛋白家族(microtubule associated protein，MAP)中一种在成熟神经元的轴突中可见的具有高可溶解性、天然状态下不具固定结构的磷酸化蛋白。tau蛋白也可见于神经元细胞体树突的隔室和核中，并在星状胶质细胞和少突胶质细胞中小范围存在，在成年人脑内，通过mRNA选择性剪接生成分别包含352～441个氨基酸的6种tau蛋白异构体，6种异构体种3种为包含3个重复序列的异构体，而其余3种为包含4个重复序列的异构体。这些重复序列是构成tau蛋白丝状物的核心，并可与一些相邻的序列构成微管结合区域，研究表明，在AD患者的脑部成像中，全部6中异构体均能在丝状物中呈现。tau蛋白是一类神经性疾病，具有高度磷酸化以及将微管相关蛋白tau蛋白(microtubule associated protein tau，MAPT)聚集成为螺旋状或者束状纤丝状，从而在脑内形成神经纤维的特性。
[0004]目前，对于tau蛋白在脑内特定沉积部位的无创检查被认为对疾病早期预测及诊断是很有帮助的。正常电子发射断层显像(positron emission tomography，PET)是一种无创性的分子成像方法，可对人脑生物学程度进行广泛的定量分析。近年来，研究者们发现了一些tau蛋白PET示踪剂并将其成功应用于脑内神经纤维疾病的病理改变显像，其中包括T807、THK
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5117和PBB3，PET利用这些tau蛋白放射性示踪剂实现了对局部以及全体tau蛋白的精确显像，这项技术的发展将为临床上提供更加及时、准确的鉴别诊断，并且在监测疾病进展和实验性临床治疗上提供更多的帮助，但是寻找合适tau蛋白PET示踪剂一直是一个难题，同时，该方法成本高，周期长。
[0005]许多研究表明，在阿尔茨海默病及其他tau蛋白引起的病理过程中，tau蛋白的过度磷酸化可能发生在最早期，其中，发生在tau蛋白的181位苏氨酸(T181)磷酸化，是最常见的磷酸化形式之一，因此，如果能快速检测出磷酸化Tau pT181蛋白，就能在早期诊断出阿尔茨海默病，这对于预防和治疗阿尔茨海默病具有重要的意义。目前，市面上只有极少数厂家开发出检测磷酸化Tau pT181蛋白的试剂盒，但存在检测灵敏度不高、特异性不强等问题。
[0006]有鉴于此，有必要开发一种检测人磷酸化Tau pT181蛋白的ELISA试剂盒来解决上述问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用，本专利技术将包含tau蛋白的181位苏氨酸(T181)磷酸化的抗原序列免疫复合物和包含tau蛋白211～239位氨基酸的抗原序列免疫复合物进行动物免疫，制备出磷酸化Tau pT181蛋白的单克隆抗体和tau(211～239)蛋白多克隆抗体，分别作为捕获抗体和检测抗体用于ELISA双抗夹心试剂盒中，并且建立了磷酸化Tau pT181蛋白的检测试剂盒使用方法及其应用。
[0008]本专利技术的一个目的在于提供一种磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体。
[0009]一种磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0010]进一步地，所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株Tau
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5D8分泌得到，所述杂交瘤细胞株Tau
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5D8已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年12月30日；保藏编号为：CCTCC NO：C2021303。
[0011]进一步地，编码所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体重链核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0012]本专利技术的另一个目的在于提供一种ELISA试剂盒。
[0013]一种ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括上述任一项所述的磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体、tau(211～239)蛋白多克隆抗体、酶标板、封闭液、HRP
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羊抗鼠IgG二抗、显色液、终止液、包被液和洗涤液。
[0014]进一步地，所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，所述tau(211～239)蛋白多克隆抗体作为检测抗体。
[0015]进一步地，所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体稀释度为(1:600)～(1:9600)；所述tau(211～239)蛋白多克隆抗体稀释度为(1:300)～(1:4800)。
[0016]进一步地，所述HRP
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羊抗鼠IgG二抗稀释度为(1:1200)～(1:9600)。
[0017]本专利技术还提供了上述任一项所述的ELISA试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0018]1)纯化单抗包被：用包被液将磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体稀释，4℃过夜，每孔100μL，4℃冰箱过夜；
[0019]2)封闭：每孔加200μL封闭液，于37℃孵育1～2h；
[0020]3)加抗原：每孔加100μL样品，于37℃孵育1～2h；
[0021]4)加纯化多抗：用封闭液将tau(211～239)蛋白多克隆抗体稀释，37℃孵育1～2h，每孔100μL；
[0022]5)加酶标二抗：用封闭液将HRP
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羊抗鼠IgG二抗稀释，37℃孵育1～2h，每孔100μL；
[0023]6)底物显色：每孔加显色液100μL，显色10min；
[0024]7)终止反应：每孔加2mol/L浓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。2.如权利要求1所述的磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞株Tau
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5D8分泌得到，所述杂交瘤细胞株Tau
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5D8已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2021年12月30日；保藏编号为：CCTCC NO：C2021303。3.如权利要求1所述的磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体，其特征在于，编码所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体重链核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.一种ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体、tau(211～239)蛋白多克隆抗体、酶标板、封闭液、HRP
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羊抗鼠IgG二抗、显色液、终止液、包被液和洗涤液。5.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述磷酸化Tau pT181蛋白单克隆抗体作为捕获抗体，所述tau(211～239)蛋白多克隆抗体作为检测抗体。6.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小川，王喆，曾宽，吴刚，
申请(专利权)人：武汉天德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：