使用多(A)和多(U)聚合酶无模板酶促合成多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及使用多(A)和多(U)聚合酶从3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用多(A)和多(U)聚合酶无模板酶促合成多核苷酸
[0001]背景
[0002]人们对通过使用无模板聚合酶(诸如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT))的基于酶促的方法来补充或替代基于化学的合成方法产生了兴趣，因为这样的酶已被证明有效，并且具有反应条件温和无毒的益处，例如Ybert等人，国际专利公布WO2015/159023；Hiatt等人，美国专利5763594；Jensen等人,Biochemistry，57：1821
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1832(2018)；等等。大多数基于酶的合成方法限于DNA合成并且需要使用可逆封闭的核苷三磷酸，以便在多核苷酸产物中获得期望的序列。遗憾地是，与未修饰的核苷三磷酸相比，天然TdT掺入这样的修饰的核苷三磷酸的效率降低。因此，已经有大量研究涉及开发新的对修饰的核苷三磷酸具有更好的掺入效率的TdT变体以合成DNA，例如Champion等人，美国专利公布US2019/0211315；Ybert等人，国际专利公布WO2017/216472等。
[0003]鉴于以上情况，如果新的无模板聚合酶可用于合成DNA和RNA并改进可逆封闭的核苷三磷酸的掺入，那么基于无模板酶促的多核苷酸合成领域将得到发展。
[0004]专利技术概述
[0005]本专利技术涉及使用多(A)和多(U)聚合酶及其变体进行多核苷酸的无模板酶促合成的方法、试剂盒和组合物。在一些实施方案中，采用多(A)和多(U)聚合酶的方法用于合成具有预定序列的RNA产物。在其他实施方案中，采用多(A)和多(U)聚合酶的方法用于合成具有预定序列的DNA产物。
[0006]在一些实施方案中，本专利技术涉及合成具有预定序列的多核苷酸的方法，该方法包括以下步骤：a)提供3
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末端核苷酸具有游离3
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羟基的起始子；以及b)重复以下的循环直至形成所述多核苷酸：(i)在延长条件下使具有游离3
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羟基的起始子或延长片段与3
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O
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封闭的
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核苷三磷酸和无模板聚合酶接触，使得起始子或延长片段通过3
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O
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封闭的
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核苷三磷酸的掺入被延长以形成3
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O
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封闭的
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延长片段，和(ii)使延长片段去封闭以形成具有游离3
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羟基的延长片段；其中无模板聚合酶是多(A)聚合酶(PAP)或多(U)聚合酶。在另外的实施方案中，起始子可以通过5
’
端附接至支持物。在另外的实施方案中，支持物可以是固体支持物。
[0007]在一些实施方案中，上述方法可以包括从起始子裂解多核苷酸的步骤。
[0008]在一些实施方案中，多核苷酸是多
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脱氧核糖核苷酸并且3
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O
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封闭的
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核苷三磷酸是3
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O
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封闭的
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脱氧核糖核苷三磷酸。在另外的实施方案中，3
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O
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封闭的
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脱氧核糖核苷酸三磷酸是3
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O
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叠氮甲基
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脱氧核糖核苷三磷酸或3
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O
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氨基
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脱氧核糖核苷三磷酸。在另外的实施方案中，多核苷酸是多核糖核苷酸并且所述3
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O
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封闭的
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核苷三磷酸是3
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O
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封闭的
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核糖核苷三磷酸。在一些实施方案中，3
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O
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封闭的
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核糖核苷三磷酸是3
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O
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叠氮甲基
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核糖核苷三磷酸。在另外的实施方案中，3
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叠氮甲基
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O
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核糖核苷三磷酸选自由以下组成的组：3
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叠氮甲基
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O
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腺苷三磷酸、3
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叠氮甲基
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O
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鸟苷三磷酸和3
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叠氮甲基
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O
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胞苷三磷酸、3
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叠氮甲基
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O
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尿苷三磷酸。
[0009]在一些实施方案中，本专利技术的方法中采用的多(A)聚合酶是这样的多(A)聚合酶变体，该多(A)聚合酶变体包含与选自SEQ ID NO:1、2、3、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25、26或27的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列和以下位置处的甲硫氨酸的取代：关于SEQ ID NO:1的位置310处，关于SEQ ID NO:2的位置318处，关于SEQ ID NO:3的位置318处，关于SEQ ID NO:8的位置316处，关于SEQ ID NO:9的位置309处，关于SEQ ID NO:10的位置316处，关于SEQ ID NO:11的位置272处，关于SEQ ID NO:12的位置316处，关于SEQ ID NO:13的位置307处，关于SEQ ID NO:14的位置313处，关于SEQ ID NO:15的位置312处，关于SEQ ID NO:16的位置317处，关于SEQ ID NO:17的位置316处，关于SEQ ID NO:18的位置316处，关于SEQ ID NO:19的位置312处，关于SEQ ID NO:20的位置310处，关于SEQ ID NO:21的位置309处，关于SEQ ID NO:22的位置317处，关于SEQ ID NO:23的位置314处，关于SEQ ID NO:24的位置307处，关于SEQ ID NO:25的位置315处，关于SEQ ID NO:26的位置316处和关于SEQ ID NO:27的位置311处。特别地，所述位置处的所述甲硫氨酸的所述取代可以选自F、Y、V、E或T。选自所述SEQ ID NO:1、2、3、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27的所述氨基酸序列还可以包含以下位置处的缬氨酸的取代：关于SEQ ID NO:1的位置234处，关于SEQ ID NO:2的位置240处，关于SEQ ID NO:3的位置240处，关于SEQ ID NO:9的位置232处，关于SEQ ID NO:10的位置240处，关于SEQ ID NO:11的位置196处，关于SEQ ID NO:12的位置240处，关于SEQ ID NO:13的位置229处，关于SEQ ID NO:14的位置236处，关于SEQ ID NO:15的位置23本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种合成具有预定序列的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供3
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末端核苷酸具有游离3
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羟基的起始子；以及b)重复以下的循环直至形成所述多核苷酸：(i)在延长条件下使具有游离3
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羟基的所述起始子或延长片段与3
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O
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封闭的核苷三磷酸和无模板聚合酶接触，使得所述起始子或延长片段通过3
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O
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封闭的
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核苷三磷酸的掺入被延长以形成3
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O
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封闭的
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延长片段，和(ii)使所述延长片段去封闭以形成具有游离3
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羟基的延长片段；其中所述无模板聚合酶是多(A)聚合酶(PAP)或多(U)聚合酶。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述起始子通过5
’
端附接至支持物。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述支持物是固体支持物。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述起始子裂解所述多核苷酸的步骤。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是多
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脱氧核糖核苷酸并且所述3
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O
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封闭的
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核苷三磷酸是3
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O
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封闭的
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脱氧核糖核苷三磷酸。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述3
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O
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封闭的
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脱氧核糖核苷酸三磷酸是3
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O
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叠氮甲基
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脱氧核糖核苷三磷酸或3
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O
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氨基
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脱氧核糖核苷三磷酸。7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是多核糖核苷酸并且所述3
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O
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封闭的
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核苷三磷酸是3
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O
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封闭的
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核糖核苷三磷酸。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述多(A)聚合酶是这样的多(A)聚合酶变体，所述多(A)聚合酶变体包含与选自SEQ ID NO:1、2、3、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列和以下位置处的甲硫氨酸的取代：关于SEQ ID NO:1的位置310处，关于SEQ ID NO:2的位置318处，关于SEQ ID NO:3的位置318处，关于SEQ ID NO:8的位置316处，关于SEQ ID NO:9的位置309处，关于SEQ ID NO:10的位置316处，关于SEQ ID NO:11的位置272处，关于SEQ ID NO:12的位置316处，关于SEQ ID NO:13的位置307处，关于SEQ ID NO:14的位置313处，关于SEQ ID NO:15的位置312处，关于SEQ ID NO:16的位置317处，关于SEQ ID NO:17的位置316处，关于SEQ ID NO:18的位置316处，关于SEQ ID NO:19的位置312处，关于SEQ ID NO:20的位置310处，关于SEQ ID NO:21的位置309处，关于SEQ ID NO:22的位置317处，
关于SEQ ID NO:23的位置314处，关于SEQ ID NO:24的位置307处，关于SEQ ID NO:25的位置315处，关于SEQ ID NO:26的位置316处，和关于SEQ ID NO:27的位置311处。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述位置处的所述甲硫氨酸的所述取代选自F、Y、V、E或T。10.根据权利要求8或9所述的方法，其中选自所述SEQ ID NO:1、2、3、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27的所述氨基酸序列还包含以下位置处的缬氨酸的取代：关于SEQ ID NO:1的位置234处，关于SEQ ID NO:2的位置240处，关于SEQ ID NO:3的位置240处，关于SEQ ID NO:9的位置232处，关于SEQ ID NO:10的位置240处，关于SEQ ID NO:11的位置196处，关于SEQ ID NO:12的位置240处，关于SEQ ID NO:13的位置229处，关于SEQ ID NO:14的位置236处，关于SEQ ID NO:15的位置236处，关于SEQ ID NO:16的位置241处，关于SEQ ID NO:17的位置233处，关于SEQ ID NO:18的位置240处，关于SEQ ID NO:19的位置240处，关于SEQ ID NO:20的位置234处，关于SEQ ID NO:21的位置233处，关于SEQ ID NO:22的位置237处，关于SEQ ID NO:23的位置238处，关于SEQ ID NO:24的位置231处，关于SEQ ID NO:25的位置239处，关于SEQ ID NO:26的位置240处，和关于SEQ ID NO:27的位置235处。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述位置处的所述缬氨酸的所述取代是丙氨酸或甘氨酸。12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述3
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封闭的
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核糖核苷三磷酸是3
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叠氮甲基
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核糖核苷三磷酸。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述3
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叠氮甲基
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O
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核糖核苷三磷酸选自由以下组成的组：3
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叠氮甲基
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O
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腺苷三磷酸、3
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叠氮甲基
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O
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鸟苷三磷酸和3
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叠氮甲基
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胞苷三磷酸以及3
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叠氮甲基
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尿苷三磷酸。
14.一种试剂盒，所述试剂盒用于进行具有预定序列的多核糖核苷酸的无模板合成，所述试剂盒包含多(A)聚合...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒂尔曼，
申请(专利权)人：DNA斯克瑞普特公司，
类型：发明
国别省市：