一种基于肝癌四项联合检测的早期诊断试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于免疫检测技术领域，公开了一种基于四项肝癌肿瘤标志物：醛酮还原酶1B10（AKR1B10）、异常凝血酶原（DCP）、甲胎蛋白（AFP）和甲胎蛋白异质体（AFP

【技术实现步骤摘要】
一种基于肝癌四项联合检测的早期诊断试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于免疫检测
，具体地说，涉及肝癌特异性标志物醛酮还原酶1B10(AKR1B10)、甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP
‑
L3)和异常凝血酶原(DCP)联合测定试剂盒，可用于肝癌或高危人群的早期筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。

技术介绍

[0002]原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是临床上常见的恶性肿瘤之一，其主要发病诱因是由肝硬化、肝炎、酒精性和非酒精性脂肪肝导致，这类患者统称为肝癌高危人群。根据世界卫生组织统计，2020年肝癌全球有91万新发病例，83万死亡病例。肝癌早期症状不明显，一旦确诊，通常已发展为晚期，失去了最佳临床治疗期。目前临床对肝癌的诊断主要采用影像学检查和血清标志物检测，由于影像学检测灵敏度较低，且价格高昂，不适用于对高危人群大规模筛查。临床常用肝癌血清标志物包括甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体和异常凝血酶原，虽然都具有一定的诊断价值，但是单一项目的诊断仍存在局限性，如果联合多种肿瘤标志物同时检测可大幅度的提升肝癌早期诊断的灵敏度和特异性，可极大的改善血清检测的漏检和错检现象。
[0003]甲胎蛋白(α
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fetoprotein,αFP或AFP)是一种相对分子质量约68kDa的癌胚糖蛋白，由胎儿肝脏和卵黄囊合成。成人中，AFP由肝细胞产生，其血清中含量极微，但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生AFP的功能，而且随着病情的恶化，AFP在血清中的含量会急剧增加。检测血清AFP水平对早期诊断原发性肝癌具有极高的临床价值，所以AFP长期升高被视为原发性肝癌的特异性指标。然而并非所有肝癌患者的肝细胞都分泌AFP，仍有30％～40％左右的患者AFP呈阴性或低浓度，具有明显的局限性。
[0004]甲胎蛋白异质体是一种单链糖蛋白，含糖量约为4％，不同组织细胞中合成的AFP糖链结构略有不同，这种糖链结构不同的AFP统称为AFP异质体。根据AFP与扁豆凝集素(LCA)不同的结合能力，可分为AFP
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L1、AFP
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L2和AFP
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L3。AFP
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L1主要表达于良性肝病中，不能与LCA结合；AFP
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L2主要出现于孕妇中，与LCA可有少量结合；AFP
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L3是肝癌细胞所特有的，与LCA特异性结合。当AFP
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L3在总AFP中的占比超过10％，提示肝癌的发生率大于95％。
[0005]异常凝血酶原(DCP)是维生素K缺乏或拮抗剂
‑
II诱导的蛋白质(Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist
‑
II，PIVKA
‑
II)，可出现于维生素K缺乏或肝细胞肝癌(HCC)患者的血清中。研究表明，在HCC之外肝病患者的血清DCP水平轻度升高，但HCC患者的血清DCP水平却显著升高，在90％的HCC患者中都会出现DCP增高，均值高达900ug/L。
[0006]醛酮还原酶1B10(Aldo
‑
keto Reductase 1B10，AKR1B10)基因定位在染色体7q33，编码一个由316个氨基酸组成的蛋白，即AKR1B10蛋白，分子量为36.02kDa。AKR1B10蛋白可由溶酶体介导的非经典分泌途径，从肿瘤细胞中分泌进入血液循环。其功能主要为保护细胞免于羧基毒性损伤；以及稳定乙酰辅酶A羧化酶α(ACCα)阻止ACCα降解，从而调节脂肪酸与脂质合成，促进肿瘤细胞的生长增殖和迁移。相关研究表明，AKR1B10在人类原发性肝癌组织中高表达，是一种新型的肝癌血清标志物。
[0007]但上述各个肝癌血清标志物单独检测准确性和可靠性都存在或多或少的问题。

技术实现思路

[0008]针对上述问题，本专利技术人开发了一种检测肝癌特异性标志物醛酮还原酶1B10(AKR1B10)、甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP
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L3)和异常凝血酶原(DCP)的联合测定试剂盒。该试剂盒可用于检测受试者血清、尿液、乳汁、肠液、大便或组织样本中的AKR1B10、AFP、AFP
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L3和DCP蛋白的浓度。采用本试剂盒，可同时检测四种肿瘤标志物的浓度，大幅度的提升肝癌早期诊断的灵敏度和特异性。在临床上可用于肝癌或高危人群的早期筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。
[0009]具体而言，本专利技术涉及一种肝癌特异性标志物醛酮还原酶1B10(AKR1B10)蛋白的测定试剂盒。醛酮还原酶1B10(AKR1B10)、甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP
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L3)和异常凝血酶原(DCP)联合测定试剂盒及其应用。
[0010]所述试剂盒，可用于肝癌或高危人群的早期筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。
[0011]第一试剂，检测AKR1B10所需的试剂组分；
[0012]第二试剂，检测AFP所需的试剂组分；
[0013]第三试剂，分离AFP
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L3所需的试剂组分；
[0014]第四试剂，检测DCP所需的试剂组分。
[0015]以及分别容纳不同浓度AKR1B10、AFP和DCP抗原的校准品与质控品。
[0016]其中，
[0017]a)所述第一试剂包括：生物素标记的兔抗AKR1B10多克隆抗体，吖啶酯标记的鼠抗AKR1B10单克隆抗体和链酶亲和素磁珠。缓冲液为0.1M PBS(pH7.0
±
0.1)，1％BSA，0.05％Tween 20，0.05％Proclin300。
[0018]b)所述第二试剂包括：生物素标记的鼠抗AFP单克隆抗体，吖啶酯标记的鼠抗AFP单克隆抗体和链酶亲和素磁珠。缓冲液为0.1M PBS(pH7.0
±
0.1)，1％BSA，0.05％Tween20，0.05％Proclin300。
[0019]c)所述第三试剂包括：LCA磁珠、清洗液和洗脱液。所述LCA磁珠是用凝集素(LCA)耦联NHS磁珠制备而成。缓冲液为0.1M PBS(pH7.0
±
0.1)，1％BSA，0.05％Tween 20，0.05％Proclin300。所述清洗液由一定浓度的Tris
‑
HCl、PBS或NaHCO3制备而成，优选的清洗液的配制方法是：50mM Tris
·
HCl(pH7.5
±
0.1)；所述洗脱液由一定浓度的Tris
‑
HCl、PBS、蔗糖、葡聚糖或D
‑
甘露糖苷制备而成，优选的洗脱液的配制方法是：0.2M PBS(pH7.0
±
0.1)，5M D
‑
甘露糖苷。
[0020]d)所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肝癌诊断的联合检测试剂盒，其特征在于，包含针对所述的肿瘤标志物：醛酮还原酶1B10、甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体和异常凝血酶原在受试者样本中的浓度的检测试剂。2.如权利要求1中所述试剂盒，其特征在于，用于肝癌或高危人群的早期筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其包括分别包装的第一试剂是检测AKR1B10所需的试剂组分；第二试剂是检测AFP所需的试剂组分；第三试剂是分离AFP
‑
L3所需的试剂组分；和第四试剂是检测DCP所需的试剂组分;以及分别容纳不同浓度的AKR1B10、AFP和DCP抗原的校准品与质控品。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于：所述第一试剂是生物素标记AKR1B10抗体和吖啶酯标记AKR1B10抗体；第二试剂是生物素标记AFP抗体和吖啶酯标记AFP抗体；第三试剂是用于分离AFP
‑
L3蛋白的LCA磁珠、清洗液和洗脱液；第四试剂是生物素标记DCP抗体和吖啶酯标记DCP抗体。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：第一试剂为生物素标记兔抗AKR1B10多克隆抗体和吖啶酯标记的鼠抗AKR1B10单克隆抗体；第二试剂为生物素标记兔抗AFP多克隆抗体和吖啶酯标记的鼠抗AFP单克隆抗体；第四试剂生物素标记兔抗DCP多克隆抗体和吖啶酯标记的鼠抗DCP单克隆抗体。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记AKR1B10、AFP和DCP抗体，是分别将鼠抗AKR1B10单克隆抗体、鼠抗AFP单克隆抗体和鼠抗CDP单克隆抗体与生物素耦联制备而成；所述吖啶酯标记AKR1B10、AFP和DCP抗体，是分别将鼠抗AKR1B10单克隆抗体、鼠抗AFP单克隆抗体和鼠抗CDP单克隆抗体与吖啶酯耦联制备而成；所述用于分离AFP
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L3蛋白的LCA磁珠，是用凝集素耦联NHS磁珠制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹哲，祝跃球，
申请(专利权)人：湖南莱拓福生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：