一种热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体GOx1-MUT、其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体GOx1

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体GOx1
‑
MUT、其编码基因和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体GOx1
‑
MUT、其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]葡萄糖氧化酶(GOD，EC 1.1.3.4)是一种氧化还原酶，由两个亚基组成二聚体，含有2个黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合位点。每个单体含有2个不同的区域：一个与部分FAD非共价但紧密结合，主要为β折叠；另一个与底物β
‑
D
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葡萄糖结合，由4个α
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螺旋支撑1个反平行的β
‑
折叠。不同来源的GOD理化性质存在差异，分子量在130～175kDa范围内，在有氧条件下，能专一性地催化β
‑
D
‑
葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。
[0003]GOD被广泛应用于食品、化工、生物医疗等领域。在食品行业，GOD可被用于催化葡萄糖耗尽真空袋中氧气，抑制微生物生长和繁殖，延长食品保质期，还可提升面制品的口感。在化工领域，GOD不仅常被应用于漂白脱色工艺，还是葡萄糖酸及其衍生物生产中的关键酶。医疗领域中，GOD是葡萄糖检测试剂盒的关键原料，也被加入牙膏中用于降低口腔疾病发生率，还能作为生物电池的电极，为生物传感器和人造器官提供持续的能源。此外，GOD的用途在转基因植物及其他生物的生产中提出，所述转基因植物及其他生物对于害虫或疾病具有降低的敏感性或增加的抗性。因此，大规模高效生产GOD具有重要的经济价值。然而，GOD在进一步的加工生产过程中，往往需要经历高温的过程，从而不可避免地使得GOD的酶活下降甚至失活。例如，在饲料加工过程中的短暂高温过程会造成葡萄糖氧化酶的失活，影响葡萄糖氧化酶的应用效果，在葡萄糖氧化酶产量得到保证的前提下，葡萄糖氧化酶的耐温性能越来越受到关注。
[0004]GOD广泛分布于动植物和微生物体内。目前工业水平的GOD生产，主要以黑曲霉和青霉作为生产菌株，相对青霉GOD而言，黑曲霉表达的GOD热稳定性较好，但都存在酶活水平低、分离纯化复杂的问题。毕赤酵母(Pichiapastoris)遗传背景清楚，易于进行遗传操作，分泌的蛋白糖基化适中，是一种进行外源蛋白表达的常用宿主，尤其是利用P.pastoris进行蛋白分泌表达，可大大简化分离纯化的过程，具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体。
[0006]本专利技术的再一目的是提供编码上述热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体的基因。
[0007]本专利技术的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体编码基因的重组载体。
[0008]本专利技术的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体编码基因的重组菌株。
[0009]本专利技术的再一目的是提供一种提高葡萄糖氧化酶的热稳定和比活的方法。
[0010]本专利技术的再一目的是提供上述热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体的应
用。
[0011]本专利技术热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体是基于亲本黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶(GOx1)基因(Genebank:FJ979866.1)进行突变的，相对于氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的亲本葡萄糖氧化酶进行以下取代：
[0012]T10K、E14L、V20Y、T30A、T34V、A36E、R37K、D43N、D70E、S74T、Q90R、V106I、S163A、I167L、A173V、I185L、V186M、K187R、S226A、Q243R、G274S、A288S、A292T、D360K、A362T、A418G、D492N、Y509E、N510H、M556L、I575V。
[0013]根据本专利技术，经过多次突变和高通量筛选获得的热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0014]SEQ ID NO：2：
[0015]SNGIEASLLKDPKLVAGRTYDYIIAGGGLAGLTVAEKLTENPNITVLVIESGSYESDRGPIIEDLNAYGEIFGTSVDHAYETVELATNNRTALIRSGNGLGGSTLINGGTWTRPHKAQVDSWETVFGNEGWNWDSVAAYSLQAERARAPNAKQIAAGHYFNAACHGLNGTVHVGPRDTGDDYSPLMRALMSAVEDRGVPTKKDLGCGDPHGVSMFPNTLHEDQVRADAAREWLLPNYQRPNLRVLTGQYVGKVLLSQNATTPRAVGVEFGTHKSNTHNVYAKHEVLLSAGSTVSPTILEYSGIGMKSILEPLGIDTVVDLPVGLNLQDQTTSTVRSRITSAGAGQGQAAWFATFNETFGKYTEKAHELLNTKLEQWAEEAVARGGFHNTTALLIQYENYRDWIVKDNVAYSELFLDTGGVASFDVWDLLPFTRGYVHILDKDPYLRHFAYDPQYFLNELDLLGQAAATQLARNISNSGAMQTYFAGETIPGNNLAYDADLSAWVEYIPEHFRPNYHGVGTCSMMPKEMGGVVDNAARVYGVQGLRVIDGSIPPTQLSSHVMTVFYAMALKIADAVLADYASMQ。
[0016]根据本专利技术的葡萄糖氧化酶基因编码上述葡萄糖氧化酶突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0017]SEQ ID NO：3
[0018]tctaatggtattgaggcttccttgttgaaagacccaaaacttgtcgccggtagaacctacgactacatcattgccggtggtggtttggctggtttgaccgttgctgagaagttgaccgagaatcctaacatcactgttttggttattgagtccggttcctacgagtctgaccgtggtccaattattgaggatttgaatgcctacggtgaaatcttcggaacttctgtcgaccacgcctatgagaccgttgagttggctactaacaatagaactgctttgatccgttccggtaacggtttgggaggatccactttgattaacggtggaacctggactagaccacataaagcccaagtcgactcctgggagactgtcttcggaaacgaaggttggaactgggactctgttgctgcttactcccttcaggctgaaagagctcgtgccccaaatgctaagcagatcgccgctggtcactactttaacgccgcatgccacggtttgaacggtactgttcacgttggac本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。2.一种葡萄糖氧化酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体。3.根据权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。4.一种提高葡萄糖氧化酶的热稳定和比活的方法，其特征在于，所述方法包括相对于氨基酸序列SEQ ID NO：1所示的亲本葡萄糖氧化酶进行以下取代的步骤：T10K、E14L、V20Y、T30A、T34V、A36E、R37K、D43N、D70E、S74T、Q90R、V106I、S163A、I167L、A173V、I185L、V186M、K187R、S226A、Q243R、G2...

【专利技术属性】
技术研发人员：江民华，李阳源，黄江，贺金玲，陈琼银，陈丽芝，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：